大鼠NAFLD形成中肝细胞增殖及部分肝切除术后肝再生的变化

摘要

目的目前非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)的发病率逐年升高，随着对NAFLD研究的深入，学者们发现NAFLD不但会发展为肝纤维化、肝硬化，甚至可进展为肝癌，同时，NAFLD患者在损伤、中毒、手术后肝脏再生的能力也可能下降。哺乳动物的肝细胞绝大多数处于静止期，病理状况下如炎症坏死、中毒损伤可诱导肝细胞快速增殖。NAFLD存在慢性氧应激、反复发生的炎症坏死、生长因子及细胞因子活化，这些因素均是促进细胞增殖的重要原因。在NAFLD是否也会引起肝细胞增殖呢?这种增殖又有何意义昵?氧应激及胰岛素抵抗被发现在其它组织如膀胱、乳腺、前列腺等的癌变发挥了重要的作用，而这种作用与二者可促进细胞增殖密切相关。ROS本身就是一个重要的致癌物质，它可引起基因突变和染色体修饰，诱导癌变。因此对NAFLD肝细胞增殖功能的研究就变得十分重要了，因为这种增殖除了可能仅为一种修复过程外，还可能与NAFLD的晚期事件肝癌相关。正常肝脏在物理、化学、感染或缺血性损伤引起的肝细胞受损或肝脏体积下降时，可诱导肝细胞快速再生增殖，以恢复肝脏原有的体积和功能。有报道显示中～重度脂肪肝患者在损伤、手术及移植后肝脏再生能力下降，恢复时间延长，并发症增多，甚至可能出现肝功能衰竭，因此肝再生功能的改变对NAFLD患者损伤后的恢复是至关重要的。迄今为止对NAFLD再生功能的实验研究还较少，结果也不一致。本研究拟通过高脂饲料喂养诱导的NAFLD大鼠作为动物模型，研究NAFLD形成过程中肝细胞增殖功能的变化及可能机制；同时对高脂喂养12W的NAFLD大鼠行70％部分肝切除术，观察术后NAFLD大鼠肝再生功能的变化，并探讨其相关的分子机制。 方法 1、动物模型： (1)选用4周龄雄性Wistar大鼠，给予高脂饲料(组成为基础饲料88％，猪油10％，胆固醇2％)，设立4W、8W、12W高脂喂养模型组(H组)，并设立同时相正常喂养组(N组)作为对照。 (2)选用4周龄雄性Wistar大鼠，高脂饲料喂养12W后进行70％部分肝切除术(切除左、中叶)，建立NAFLD大鼠肝再生模型组(F组)，设立术后0h、1h、12h、24h、36h五个时相点，并对正常大鼠进行70％肝切除术设立同时相点正常肝再生组(C组)作为对照。 2、对高脂喂养模型组(H组)采用免疫组化染色法检测PCNA的阳性表达率、流式细胞术分析细胞周期的PI及SPF值、RT-PCR及Western-blot检测cyclinD1、P-ERK的表达，同时观察肝脏大体形态、组织病理学改变。 3、采用NAFLD大鼠肝再生模型(F组)，计算术后动物存活率，在光镜及透射电镜下观察残肝组织病理学改变，计算再生肝重比及核分裂像计数，利用免疫组织化学染色法检测PCNA的表达、流式细胞术分析细胞周期的PI及SPF值、RT-PCR法检测cyclinD1及c-fos的mRNA表达，Western-blot检测cyclinD1、P-ERK、P21的蛋白表达。 结果： 1、成功地建立了高脂饲料喂养的NAFLD大鼠模型，4W、8W时出现轻～中度脂肪肝的病理学改变；高脂喂养12W大鼠肝脏出现大小泡混合性脂肪变，脂变肝细胞达到70％左右，为中～重度脂肪肝，小叶及汇管区有炎性细胞浸润，部分已演进为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatosishepatitis，NASH)。 2、高脂喂养4W、8W组大鼠SPF、PI值与正常喂养组无明显差异，PCNA阳性表达率及cyclinD1的mRNA及蛋白表达较正常组也无明显增高(P＞0.05)；高脂喂养12W的NAFLD大鼠SPF、PI值、PCNA阳性表达率、cyclinD1的mRNA及蛋白表达则明显高于正常喂养组，有显著性差异(P＜0.01)；H12W组P-ERK蛋白表达也显著高于C12W组(P＜0.01)。 3、NAFLD大鼠部分肝切除术后残肝的组织病理学改变显示肝细胞内大量脂滴沉积，肝窦狭窄迂曲，细胞核小，常染色质少，核分裂像细胞少，线粒体及粗面内质网未见扩张，可见大量溶酶体吞噬坏死细胞器碎片。术后24h、36h可见少量处于有丝分裂期细胞，核分裂像计数明显低于正常肝再生组； 4、NAFLD肝再生12h、24h、36h组动物存活率分别为91.7％、75％、66.7％，正常肝再生组术后各时相点的动物存活率均为100％。NAFLD肝再生组在术后各时相点的再生肝重比及核分裂像计数均明显低于正常肝再生组(P＜0.01)；PCNA的阳性表达率在术后12h、24h、36h均低于正常肝再生组(P＜0.01)，且表达的高峰较正常组延迟出现；流式细胞术检测PI及SPF值显示F组在术后各时相点均明显低于C组(P＜0.01)。 7、NAFLD肝再生组cyclinD1的mRNA及蛋白表达水平在术后24h、36h明显低于正常肝再生组(P＜0.01)，且36h的表达较24h增高(P＜0.05)；P-ERK与P21在术后各时相点的蛋白表达均明显高于正常肝再生组同时相点(P＜0.01)，术后24h达到峰值，二者的表达趋势基本一致；c-fos在术后早期没有被激活，表达高峰延迟至术后24h，且12h后的活化水平明显高于正常肝再生组同时相点(P＜0.01)。 结论： 1、高脂喂养4W、8W的轻～中度NAFLD大鼠肝细胞增殖功能未发生变化，而高脂喂养12W时肝脏呈中～重度脂变，部分出现NASH表现，此时大鼠肝细胞增殖活跃。 2、高脂喂养12W时大鼠肝组织内ERK等激酶的活化增加，cyclinD1表达明显增高，P-ERK促进了cyclinD1表达。 3、高脂饲料诱导的中～重度NAFLD大鼠进行70％部分肝切除术可成功建立NAFLD肝再生模型，术后动物存活率下降，DNA合成障碍，肝再生进程主要被阻滞在G1/S转换点。 4、NAFLD大鼠肝再生中立即早期基因c-fos表达延迟、后期活化水平增高，直接抑制了继发早期基因cyclinD1的表达，同时过度活化的P-ERK通过诱导P21蛋白表达间接抑制cyclinD1及CDK的活性，这可能是NAFLD大鼠肝再生功能改变的重要机制之一。

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摘要

前言

第一部分大鼠非酒精性脂肪肝形成过程中肝细胞增值功能的变化

第二部分非酒精脂肪肝大鼠部分肝切除术后肝再生功能的变化及机制

全文结论

致谢

参考文献

照片

文献综述肝再生信号转导通路的研究进展

攻读硕士学位期间撰写论文情况