人胚胎视网膜移植到光诱导视网膜变性猪的视网膜下腔的实验研究

摘要

目的：通过将人胚胎视网膜神经上皮层和色素上皮层联合移植到光诱导视网膜变性猪的视网膜下腔，探讨大动物视网膜移植的方法，观察此类异种移植后的安全性、移植物和宿主的活体及离体形态学变化、以及宿主视功能的改变。并且探讨人胚胎视网膜的短期、中期及长期保存的适宜方法。从而为临床视网膜移植治疗视网膜变性疾病提供理论基础。 方法：本研究首先用白色荧光灯持续照射6月以上，建立小型猪的光诱导视网膜变性模型。然后对12-35周健康流产人胚胎视网膜进行Ames'液、中期保存液(DX液)、负80度冰箱、深低温程序降温仪4种方法的保存，并通过台盼蓝染色、MTT比色来检测保存后细胞活性率，HE染色来评估其保存后结构。同时，选12-30周健康流产胎儿为供体，用准分子激光微切削脉络膜制备视网膜神经上皮层和色素上皮层(RPE)联合移植片。对14只光变性猪(28眼)和3只正常猪(5眼)共33眼行手术。光变性猪移植手术25眼，伪手术3眼；正常猪移植手术4眼，伪手术1眼。术后1周、1、2、3、5、8月行检眼镜、眼底彩照、荧光造影以及多焦视网膜电图(mfERG)和多焦视诱发电位(mfVEP)检查，并通过HE染色、免疫荧光，观察移植物在宿主视网膜下腔的存活能力和发育状况，移植物与受体视网膜的整合方式以及视网膜功能和视皮层功能的变化。 结果：(1)、白色荧光灯光照6个月后，猪眼mfERG的1-6环各指标均比正常猪差，尤以1-2环振幅密度下降明显；mfVEP的P1波潜伏期在3环、5环比正常猪延长，电镜下见光变性猪视网膜光感受器层线粒体肿胀、胞浆溶解。(2)、人胚胎视网膜的Ames'液短期保存时间在4h内效果最佳，最长不应超过6h；DX液中期保存1-2天时效果较好；负80度冰箱中期保存1周时尚可；在长期保存1月时，深低温程序降温后的效果好于负80度冰箱。(3)、早期视网膜移植手术成功率66.67％。术后8月内行眼底彩照和荧光造影，发现移植区无荧光渗漏，有1只猪眼术后8月仍见移植区新生血管，1只猪眼术后5月仍见移植区内有荧光遮蔽。术后5月内可供取材10眼，均为光变性猪眼，在宿主视网膜下腔找到移植物7眼，移植物存活率为70％，包括3种情况：①视网膜细胞样结构4眼，②RPE样结构1眼，③胶质和视网膜细胞样结构夹杂2眼。移植物与宿主形态整合的特点是：①术后1月的1眼移植物局部与宿主视网膜有丝状连接，但并未形成融合；②术后2月的3眼移植物局部与宿主接触，未见有融合，其中1眼移植物毗邻宿主视网膜面有GFAP阳性细胞分布；③术后3-5月的3眼移植物局部与宿主视网膜有融合，1眼移植物中可见Chx10阳性细胞散在分布(术后3月)，1眼移植物中有GFAP阳性细胞散在分布，并且在融合部位相对较多(术后5月)。(4)、光变性猪眼mfERG检查显示，术后1月后极部中心(1环)视网膜功能非常显著升高，5、8月后极部中央(1、2环)视网膜功能有改善，而3-6环视网膜功能无明显改善，伪手术眼术后视网膜功能没有改善。光变性猪眼移植术后1-6环mfVEP的各项电生理指标均与术前无明显差异。 结论：(1).白色荧光灯持续照射6个月以上，可慢性诱导小型猪视网膜光感受器层变性。(2).人胚胎视网膜的短期保存在Ames'液中不应超过6小时，中期保存在DX液中1-2天时较好，长期保存1月时，深低温程序降温后的效果好于负80度冰箱。(3).12-30周人胚胎视网膜能在猪视网膜下腔安全存活至少8月，并与宿主视网膜可以形成有限的整合。(4).移植的人胚胎视网膜在术后改善了光变性猪后极部中央视网膜的功能，而mfVEP没有明显变化。(5).形态学上的有限整合和功能上的显著升高，提示：可能是移植物导致的神经营养保护作用提高了宿主的视功能。

目录

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摘要

前言

第一部分 慢性光诱导猪视网膜变性模型的建立及鉴定

第二部分 人胚胎视网膜取材和保存

第三部分 人胚胎视网膜移植到正常猪和光变性猪视网膜下腔方法的改进及术后形态学观察

第四部分 正常猪和光变性猪视网膜移植术后视功能的检测

全文结论

致谢

参考文献

文献综述神经营养因子治疗视网膜变性疾病的研究进展

附博士阶段以第一作者发表论文

以第一署名人获得及申请专利