ABO血型正反定型蛋白质芯片的构建及应用研究

摘要

在献血及输血过程中，ABO和RhD血型鉴定及HIV-1、HIV-2、HBV、HCV和Syphilis的检测是国家强制性检测项目。目前血型检查采用平板法，血液病原微生物则用ELISA法检测。现行检测方法的主要缺陷是不能同步检测，而且测试时间长、耗费试剂多。而芯片技术由于具有高通量、可平行检测、用时少、节省试剂、易于实现自动化等优点，已日益引起医学检验领域的关注。本研究拟构建可对ABO血型进行正反定型的蛋白质芯片，并检验其灵敏度、准确性以及稳定性，以便为构建包括ABO、Rh血型正反定型和经血液传播病原体检测的蛋白质芯片奠定基础。 材料与方法 第一部分硅酸和醛基基片的优劣对比 1.硅酸修饰基片的制作及血型抗原抗体反应条件的优化：将硅酸钠溶液滴加到清洁玻片上，烘干后加入冰乙酸液，在玻片表面形成硅酸薄膜以制备成硅酸基片。包被抗-A、抗-B于硅酸基片上，并作阴性对照1(未经硅酸修饰处)加血型抗体、阴性对照2(经硅酸修饰处)加生理盐水。然后放入湿盒，4℃保存过夜。然后加入2％的对应RBC生理盐水混悬液室温反应5min，用PB(pH8.0)冲洗后，立即在显微镜下计数RBC。 在3min、5min、10min的反应时间、24℃和37℃的反应温度以及pH5.7、6.5、7.0、7.5、8.0的条件下进行组合，并分为20个实验组，每组进行4次实验。计数已包被血型抗体的硅酸基片结合的红细胞(RedBloodCells，RBC)数，取均值。 2.硅酸和醛基修饰基片包被血型抗体的比较：将0.4μl血型抗体分别包被在硅酸和醛基修饰的玻片上，然后加入对应的2％RBC生理盐水混悬液与之反应，经PB冲洗后，立即在显微镜下计数10个低倍视野下的RBC数，以求出RBC的均值/低倍视野。 3.包被抗原的硅酸和醛基基片结合荧光标记抗体的比较：将不同稀释倍数的兔血清分别包被在硅酸和醛基修饰的玻片上，用荧光标记的山羊抗兔IgG与之反应，通过光谱扫描仪检测出的荧光信号强度，比较两种不同玻片对抗体吸附能力的强弱、荧光染色背景的高低以及反应的特异性。 第二部分醛基修饰基片构建ABO血型正反定型检测芯片的研究 1.ABO血型正反定型检测芯片的构建及重复性实验：将倍比稀释的ABO血型抗体及血型物质固定于基片。同时作如下阴、阳性对照：阴性对照组1：最低浓度血型物质或抗体+FITC标记的抗C1qIgG；阴性对照组2：BSA；阴性对照组3：包被5min的FITC标记的抗C1qIgG；阳性对照：避光保存并包被了10h的FITC标记的抗C1qIgG。 重复性检测：用新构建的芯片对标准A型、B型RBC及抗-A、抗-BMcAb试剂进行5次重复检测，并计算反应后荧光信号强度的变异系数。 2.ABO血型正反定型芯片检测法的灵敏度与特异性实验：用包被了最高稀释倍数达40960倍的抗体、20480倍的血型物质的蛋白质芯片，与对检测试剂进行倍比稀释的金标准平板法分别对标准A型、B型RBC及抗-A、抗-BMcAb试剂进行正反定型比较。 第三部分ABO血型正反定型检测芯片的临床应用 1.芯片法同时检测AB型RBC和O型血清：用同一芯片对AB型RBC和O型血清进行同时检测。 2.用芯片法对献血标本进行ABO正反定型检测：将20份随机采集的健康献血者的血型标本，分别用蛋白检测芯片进行ABO血型正反定型的检测。 主要结果 第一部分硅酸和醛基基片的优劣比较 1.包被血型抗体的硅酸基片均可结合其特异性的RBC，结合的RBC数为297个/LP～367个/LP，与特异性RBC的结合率达100％；而两阴性对照结合的RBC数均为零，与特异性RBC的结合率为0％。血型抗原抗体在硅酸基片上反应的最佳条件是：反应温度为24℃，pH8.0的条件下反应5min。 2.已包被血型抗体的硅酸和醛基基片结合的RBC个数分别为332±35个/LP和257±20个/LP，前者比后者结合的RBC多29.6％。 3.硅酸基片上包括阴阳性对照在内的全部点样点的荧光强度均集中分布于42500～44900；醛基基片的两阴性对照处荧光强度均值不超过6800，阳性对照为43100，兔血清由80倍至10倍稀释、浓度逐渐升高的过程中，其荧光强度也由33000逐渐升至41200。 第二部分ABO血型正反定型检测芯片的构建及效果观察 1.三处阴性对照的荧光强度均不超过7200，阳性对照不低于41600。包被蛋白质浓度逐渐升高的过程中，抗体的荧光强度由35600～35700逐渐升高到42300～42800；抗原的荧光强度也由35600～36100逐渐升高到42800～43000。五种包被蛋白质各自的变异系数(CV)分别为：抗-A7.4％，抗-B7.0％，A物质5.2％，B物质5.8％，荧光标记抗体4.7％。 2.ABO血型正反定型芯片的灵敏度，正定型为1：40960，反定型为1∶20480。平板法正定型的灵敏度为1∶256，反定型的灵敏度为1∶2。芯片法与平板法对ABO血型正反定型的符合率达100％。 第三部分ABO血型正反定型检测芯片的临床应用 1.芯片中，三处阴性对照的荧光强度均不超过8500；阳性对照42800～44000；包被蛋白质的浓度由1024倍稀释升至8倍稀释的过程中，其荧光强度也由21000～32100逐渐升高到39000～42000。 2.扫描结果显示：对20例标本检测后的芯片均呈现了高度的特异性，可达100％。 全文结论 1.以醛基基片为载体、成功构建的蛋白质芯片可以平行地对ABO血型进行正反定型检测，而平板法只能逐项进行检测。蛋白质芯片法具有与金标准平板法相同的特异性，而灵敏度更高。 2.如果避光存放，ABO血型正反定型芯片对检测结果的保存可达3个月以上，而平板法只能保存数小时。 3.ABO血型正反定型蛋白质芯片的成功建立，并采用补体Clq和FTTC标记的抗C1qIgG作为反应示踪物，为抗原和抗体集成于同一芯片，并用同样的标记物指示，实现抗原抗体的同步检测，提供了简便、可行的技术方法。 4.构建的ABO血型正反定型蛋白质芯片是一种特异性和灵敏度较高，稳定性较好的检测方法，输血检测证明用芯片法对ABO血型进行正反定型是可行的，这为今后开发对血型正反定型和经血传播病原体同时进行检测的蛋白质芯片奠定了技术基础。

目录

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摘要

前言

第一部分硅酸和醛基基片的优劣比较

第二部分醛基修饰基片构建ABO血型正反定型检测芯片的研究

第三部分ABO血型正反定型检测芯片的临床初步应用

全文结论

图片

参考文献

致谢

文献综述 输血检查微阵列技术

攻读硕士学位期间撰写的文章