Alzheimer's病小鼠脑内Aβ清除的实验研究和认知损害保护因素的流行病学研究

摘要

本研究开展了AD防治的基础和流行病学两个部分的研究：1.通过在体转染人源性抗淀粉样物质(Amyloid-beta，Aβ)单链抗体基因来清除转基因AD小鼠模型脑内Aβ，探索AD防治的新方法。2.通过开展前瞻性流行病学调查研究，探讨老年人休闲活动和认知损害发生之间的关系，寻找老年人群认知功能损害发生的保护因素。 第一部分在体转染人源性抗Aβ单链抗体基因清除AD小鼠脑内Aβ的实验研究 目的 近10余年来大量病理学、遗传学和转基因动物等方面的证据表明，Aβ是AD的致病物质。降低脑内Aβ水平是防治AD的一个重要策略。抗Aβ免疫治疗是近年来在此方面所取得的一个重要进展。临床研究表明，Aβ疫苗接种能有效产生抗Aβ抗体，清除AD患者脑内Aβ，减轻Aβ相关病理改变，并提高认知水平。因此免疫治疗是目前最有希望成为首个有效清除患者脑内Aβ的AD防治新方法。但是，免疫治疗存在着引起中枢神经系统(CentralNerveSystem，CNS)自身免疫性炎症反应的严重副作用。CNS自身免疫性炎症反应是由于Aβ疫苗激活了自身免疫性细胞毒性T细胞而发生的。如何避免CNS炎症反应的发生，是AD免疫治疗目前急需解决的重要科学问题。 为了克服免疫治疗的CNS自身免疫性炎症反应这一副作用，本研究采用免疫治疗和基因治疗相结合的策略，探讨在体转染人源性抗Aβ单链抗体基因对AD小鼠脑内Aβ的清除作用，以及对CNS炎症细胞的激活情况。 方法和结果 1.通过制备人源性抗Aβ单链抗体蛋白，并检测其生物活性，观察到：(1)人源性抗Aβ单链抗体具有Aβ42亲和能力，表明人源性抗Aβ单链抗体能够同时识别Aβ40和Aβ42。(2)人源性抗Aβ单链抗体能够抑制Aβ42单体聚合形成Aβ原纤维。(3)人源性抗Aβ单链抗体能够促进Aβ原纤维的解聚。上述实验结果表明人源性抗Aβ单链抗体具有清除脑内Aβ的潜力。 2.通过构建人源性抗Aβ单链抗体-腺相关病毒载体(AAV-scFv)并进行在体转染，观察到：(1)在CNS和肌肉组织，人源性抗Aβ单链抗体转染后1周开始检测到表达，到注射后3月时仍持续表达。(2)侧脑室注射后，人源性抗Aβ单链抗体的表达广泛分布在CNS的多个部位(嗅球、皮质、海马、丘脑、小脑和脊髓)，并主要表达于神经元。肌肉注射后，人源性抗Aβ单链抗体表达于肌肉、肝脏和肠道等组织。 3.通过在体转染人源性抗Aβ单链抗体基因，观察到：(1)人源性抗Aβ单链抗体在体(海马、侧脑室和肌肉)转染有效清除了脑内Aβ。(2)人源性抗Aβ单链抗体在体(海马、侧脑室和肌肉)转染能有效改善小胶质细胞激活和星形胶质细胞增生等Aβ相关病理改变。(3)人源性抗Aβ单链抗体在体(海马、侧脑室和肌肉)转染后脑内未见T淋巴细胞浸润。 结论 1.本研究采用人源性抗Aβ单链抗体，实现了对AD小鼠脑内Aβ的清除，改善了小胶质细胞激活和星形胶质细胞增生等Aβ相关病理改变，同时避免了CNS自身免疫性炎症反应的发生。 2.人源性抗Aβ单链抗体清除脑内Aβ的作用机制主要是促进Aβ原纤维的溶解，抑制Aβ单体的聚积，以及隔离血液中的Aβ以促进脑内Aβ的外流。抗Aβ单链抗体对脑内Aβ的清除不依赖于小胶质细胞的吞噬作用。 3.采用基因治疗策略，解决了抗Aβ单链抗体的长期来源，并拓宽了抗Aβ单链抗体的应用途径(长期脑内用药)。 第二部分休闲活动和认知损害关系的流行病学研究 目的 阐明日常生活因素和老年人群认知损害发生之间的关系，寻找认知损害发生的保护因素，对于认知损害的防治具有重要的意义。然而，目前在这方面的认识非常有限。近年来观察到，在西方国家的老年人群中，休闲活动和认知损害的发生相关。参加休闲活动(智力活动、体育活动和社会活动)越多，发生认知损害的危险性就越低。但是，在中国人群中，对于老年人群的休闲活动和认知损害的关系则不清楚。由于我国和西方国家在休闲方式和文化背景方面存在着较大的差异，在中国老年人群中休闲活动和认知损害发生的关系可能有别于西方人群。为此，本研究在重庆市区55岁以上老年人群中开展了关于休闲活动和认知损害发生关系的前瞻性随访研究。 对象和方法 1.研究人群 本研究随机选择了重庆市高新区和江北区下属9个居委会，对其老年人群进行调查。本研究随访起止时间为1999年-2004年。基线调查的入选标准为：(1)年龄在55岁以上(包括55岁)，(2)本地常驻居民。排除标准为：(1)严重失语和视听障碍者，(2)严重的晚期疾病者，(3)长期智能障碍者，(4)不能提供可靠信息者，(5)严重颅脑外伤或煤气中毒史者，(6)精神分裂症者，(7)基线调查时诊断为认知损害者，(8)已外出或不愿参加者。 2.基线调查 所收集的资料包括：人文资料、吸烟和饮酒、所患疾病、休闲活动、日常生活自理能力、认知功能和抑郁状况。 3.随访 每年对入选者进行随访。随访时认知功能采用相同的神经心理检查量表进行检测。新发认知损害定义为在基线调查时认知功能正常，而在随访期间发生认知损害者。 4.统计分析 对所收集的资料进行单因素分析。在单因素分析中，根据变量情况选择Pearson卡方检验、Fisher精确检验、独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验等方法。在多因素分析中，利用Cox比例风险回归模型分析每项休闲活动和休闲活动类别与认知损害发生的关系。 结果 1.随访 在基线调查时，所抽取的社区共有55岁以上老年人9341人，在基线调查后有3904人被排除，5437人(58.2％)被纳入本项随访研究。本研究平均随访时间为4.7±0.5年，在此期间，有273人(5.0％)死亡，493人(9.1％)失访或退出研究，593人(10.9％)发生认知损害。认知损害的平均年发生率为2.3％。 2.基线特征 对发生认知损害者和未发生认知损害者在基线调查时所调查因素的单因素分析表明，同未发生认知损害者(n=4844)比较，发生认知损害者(n=593)的年龄偏大(68.5±6.8vs62.8±5.8，p＜0.001)，女性偏多(57.5％vs47.2％，p＜0.001)，教育水平偏低(39.1％vs27.5％，p＜0.001)，蓝领比例偏高(57.3％vs33.8％，p＜0.001)，当前吸烟者偏多(22.9％vs18.5％，p=0.009)，每日饮酒者偏多(12.8％vs9.3％，p=0.006)，所患疾病数量偏多(1.2±1.0vs1.0±0.9，p＜0.001)，长期使用非甾体类抗炎药者偏少(0.5％vs0.6％，p=1.0)，有抑郁症状者偏多(9.7％vs6.1％，p=0.001)，基线MMSE评分偏低(24.0±2.5vs27.8±2.3，p＜0.001)，ADL评分偏高(24.6±11.2vs20.9±5.2，p＜0.001)。 3.基线休闲活动的单因素分析 与未发生认知损害者比较，发生认知损害者参与看电视(37.96±11.96vs18.84±10.82，p＜0.001)的时间偏多，参与棋牌(2.45±3.16vs7.48±7.61，p＜0.001)和阅读(0.39±1.14vs1.53±2.75，p＜0.001)的时间偏少。对休闲活动进行分类比较显示，与未发生认知损害者比较，发生认知损害者参与智力活动(4.44±7.57vs10.71±10.63，p＜0.001)的时间偏少，而参与体育活动(1.43±2.85vs1.43±2.65，p=0.387)和社会活动(0.13±0.57vs0.15±0.62，p=0.176)的时间无统计学差异。 4.多因素分析 对所有参与者(ModelA，n=5437)的分析结果显示，在单项休闲活动中，参与棋牌(HR0.92，95％CI0.89-0.94)和阅读(HR0.81，95％CI0.74-0.87)降低了认知损害发生的危险性。对休闲活动分类的分析结果显示，参与智力活动(HR0.95，95％CI0.94-0.96)降低了认知损害发生的危险性。为排除早期认知损害和所患疾病的潜在影响，本研究进一步对基线MMSE评分满分及在第一年随访时未诊断为认知损害者(ModelB，n=1423)和所患疾病数量为0的对象(ModelC，n=1857)进行分析，其结果在本质上与对所有参与这的分析结果相似。 结论 1.本研究人群中认知损害的平均年发生率为2.3％。 2.对休闲活动进行单项研究，结果表明参与棋牌和阅读可能降低认知损害发生的危险性。 3.对休闲活动进行分类研究(智力活动、体育活动和社会活动)，结果表明参与智力活动可能降低认知损害发生的危险性。

目录

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摘要

前言

第一部分 在体转染人源性抗Aβ单链抗体基因清除AD小鼠脑内Aβ的实验研究

第二部分 休闲活动和认知损害关系的流行病学研究

致谢

参考文献

文献综述 Alzheimer's病脑内Aβ的清除机制与治疗策略：进展、问题和展望

博士研究生期间发表的论文