分子信标技术定量检测脲原体U.Parvum和U.Urealyticum及临床应用研究

摘要

目的： 人类脲原体已被重新分类为2个种，即Ureaplasmaparvum(U.Parvum或U.P)与Ureaplasmaurealyticum(U.Urealyticum或U.U)，目前尚无对其进行分种定性和定量检测的试剂盒。本研究根据脲原体尿素酶B基因序列在脲原体U.Parvum和U.Urealyticum之间的差异建立了分别检测脲原体U.Parvum和U.Urealyticum的定性PCR方法以及分子信标实时荧光定量PCR反应体系，为鉴别不同种脲原体感染性疾病、研究不同种脲原体的致病机制以及进行不同种脲原体的流行病学调查提供了新的技术手段。 方法： l、根据GenBank中脲原体尿素酶B基因序列，在BeaconDesigner2.1软件上分别设计U.P和U.U特异性引物与分子信标。 2、对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立U.P和U.U定性PCR反应体系。通过扩增产物直接测序、特异性试验、构建标准株PCR产物重组质粒进行灵敏性试验以及方法学比较对定性PCR反应体系进行综合评估。 3、测定分子信标的信号背景比值(S/B值)以及绘制分子信标热变性曲线把握分子信标特性。 4、对反应体系中的MgCl2、引物、dNTP以及探针的浓度进行优化后建立U.P和U.U分子信标实时荧光定量PCR反应体系。通过特异性、灵敏性和重复性试验以及方法学比较对分子信标PCR反应体系进行评估。 主要结果： 1、U.P和U.U定性PCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现326bp的条带。MgCl2、引物以及dNTP在2个定性PCR反应体系中的最佳终浓度相同，分别为：1.5mmol/1、0.25μmol/1以及0.2mmol/1。2个PCR反应体系中的最佳退火温度同为54℃。标准株及阳性临床标本的PCR扩增产物测序结果与GenBank中的序列比对一致。 2、15株其它细菌与2个定性PCR体系无交叉反应。2个定性PCR体系的检测限度均为10拷贝/μl的重组质粒DNA。 3、U.P和U.U分子信标的S/B值均大于20。分子信标热变性曲线表明分子信标只有与互补的寡核苷酸结合才有荧光强度的升高，并且分子信标在55℃以下时当有目的片段存在时可以形成稳定的杂交，而无结合目的片段的分子信标则形成稳定的“发夹”结构，荧光背景低。 4、U.P分子信标荧光定量PCR反应体系中MgCl2、引物、dNTP、U.P分子信标最佳终浓度分别为4.5mmol/1、0.3μmol/1、0.3mmol/1、0.3μmol/1。U.U分子信标荧光定量PCR反应体系中MgCl2、引物、dNTP、U.U分子信标的最佳终浓度分别为5.0mmol/1、0.3μmol/1、0.4mmol/1、0.3μmol/1。2个定量PCR体系均能检测1拷贝/μl的标准模板，检测上限可到106拷贝/μl。 5、其它15株细菌与2个分子信标荧光定量PCR反应体系无交叉反应。批内重复性试验CV均小于2％，天间重复性试验CV均小于5％。 6、U.P和U.U分子信标定量PCR反应体系检测临床标本脲原体的总阳性检出率为60.4％(29/48)，其中U.Parvum阳性20例，而U.Urealyticum阳性9例。2个分子信标定量PCR反应体系与培养法的阳性检出率(39.6％，19/48)比较有统计学差异，P＜0.05，与华美PCR法(58.3％，28/48)以及U.P和U.U定性PCR反应体系的阳性检出率(54.2％，26/48)比较无统计学差异，P＞0.05，但高于两者的阳性检出率。以培养法作为参考方法，U.P和U.U分子信标荧光定量PCR反应体系的灵敏度和特异性分别为：94.7％和62.1％，U.P和U.U定性PCR反应体系的灵敏度和特异性分别为：94.7％和72.4％，华美PCR法的灵敏度和特异性为：94.7％和65.5％。 结论： 1、U.P和U.U定性PCR反应体系能够对脲原体标准株及临床标本中脲原体进行分种鉴别并具有高度的特异性和灵敏性，可以满足临床上对脲原体进行分种鉴别的要求，同时为分子信标荧光定量PCR方法的建立奠定了基础； 2、U.P和U.U分子信标S/B值及热变性曲线能够充分反映分子信标的高度灵敏性、特异性以及热动力学变化特征，为成功建立分子信标实时荧光定量PCR方法提供了保障； 3、兼顾到多种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系的影响，建立了一套较为合理的分子信标实时荧光定量PCR反应体系的优化方案； 4、U.P和U.U分子信标实时荧光定量PCR反应体系能够快速对脲原体标准株及临床标本中脲原体进行分种定量检测并具有高度的特异性、灵敏度以及重复性，能够为鉴别不同种脲原体感染性疾病、研究不同种脲原体的致病机制和进行脲原体不同种的流行病学调查提供技术上的支持。

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文摘

英文文摘

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声明

前 言

第一部分 检测脲原体U.Parvum和U.Urealyticum的定性PCR方法的建立

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 检测脲原体U.Parvum和U.Urealyticum的分子信标实时荧光定量PCR方法的建立

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

附 图

参考文献

文献综述 活细胞荧光原位杂交------分子信标成像技术

攻读硕士学位期间撰写的文章