慢性乙型肝炎患者HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞增殖老化研究

摘要

慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)危害严重，是肝癌、肝硬化的首要病因。2005年，慢性乙型肝炎被列为我国四大重点防治的传染病之一。明确乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)持续感染的免疫病理机制，对慢性乙型肝炎的防治至关重要。HBV特异性CD8+T细胞，即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTLs)介导的免疫应答在病毒清除过程中起主导作用；HBV特异性CTLs功能低下是慢性乙型肝炎病毒持续感染的关键原因。探讨HBV特异性CTLs功能低下的机制是研究的焦点。 在慢性乙型肝炎研究中发现，患者的HBV特异性CTLs在体外给予抗原肽刺激后不能增殖或增殖能力下降；而急性自限性乙型肝炎患者以及恢复期患者的HBV特异性CTLs在体外给予抗原肽刺激后可以迅速增殖，分泌细胞因子并行使其效应功能。克隆扩增是淋巴细胞最基本的功能，抗原特异性CTLs增殖的同时获得效应功能,CTLs的增殖能力是病原体能否清除的关键。因此慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs增殖能力下降是其功能低下的关键。然而，慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs不能增殖或增殖能力下降的原因并没有进一步的研究报道。 T细胞增殖老化(replicativesenescence)是指细胞有新陈代谢，但是增殖能力下降或不能进一步增殖。老化T细胞的首要特点是：细胞增殖能力下降、CD28表达缺失。老化T细胞还具有以下重要特点：(1)细胞表面表达自然杀伤细胞相关受体(naturalkiller-associatedreceptors，NKRs)，如CD56、CD57、杀伤细胞抑制性受体(killerinhibitoryreceptor，KIR)；(2)细胞对凋亡耐受；(3)细胞多处于分化晚期或终末期；(4)老化T细胞效应功能低下。T细胞增殖老化是正常人体老化的一部分，是老年人免疫功能低下的重要原因。 然而T细胞增殖老化的过程与年龄无关，因为它是根据T细胞增殖历史而不是人的寿命命名的。研究表明抗原持续存在引起的免疫活化，迅速导致病毒特异性CTLs老化。在年轻的慢性炎症、持续感染患者体内能够发现老化的T细胞，与患者的年龄不相符，并且这群细胞与疾病的严重程度密切相关，它们的存在和意义正引起人们的关注。在持续HIV感染患者及持续的巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染患者发现，病毒特异性CTL增殖能力下降，细胞效应功能低下，并且CTLs不表达CD28、耐受凋亡，与增殖老化的T细胞相同。增殖老化的病毒特异性CTLs功能低下，是病毒持续感染不能得到有效控制的原因。 基于上述研究结果，我们推测慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs功能低下是由于CTLs处于增殖老化状态。本研究拟利用肽-MHC-Ⅰ类分子五聚体(pentamer)技术、胞内细胞因子染色(intracellularcytokinestaining，ICCS)技术和多色流式分析技术，根据老化T细胞的特点，直接离体情况下(directlyexvivo)进行以下研究：1.检测慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTLs表面标志CD27、CD28、CD45RA、CD45RO的表达，以明确HBV特异性CTLs的CD28表达情况和细胞分化状态；2.检测CD56、CD57、KIR表达以了解NKRs在HBV特异性CTLs的表达情况；3.检测Bcl-2和Ki-67的表达了解细胞的增殖和凋亡情况；4.检测perforin、granzymeB和IFN-γ的表达明确细胞的功能状态。通过四部分的研究以证实慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs处于增殖老化状态。结果如下： 首先，我们选取三个在急性感染时具有代表性的优势性表位，即针对HBV核心抗原core18-27，被膜抗原env335-343以及聚合酶抗原pol575-583的pentamer，检测了慢性乙型肝炎患者外周血中三个表位特异性CTLs的频率。结果发现，在病毒载量＜107copies/ml的患者，能够检测出HBcAg(18-27)特异性CTL，HBeAg(335-343)特异性CTL及HBp(575-583)特异性CTL；在病毒载量＞107copies/ml的患者，能够检测出HBeAg(335-343)特异性CTL及HBp(575-583)特异性CTL。这与我们工作小组既往的研究报道相同。结果提示慢性乙型肝炎患者体内HBV特异性CTLs并没有被克隆清除。 在这部分研究的结果中，我们发现两例患者所感染的HBV，其HBVDNA编码的HBcAg(18-27)表位为FLPSDFFPSI，第27位氨基酸为Ⅰ；而在这两例患者体内检测出针对HBcAg(18-27FLPSDFFPSV)特异性的CTL。推测患者最初是野生型HBV感染，最终在肝脏被清除，而负性筛选的变异株逐渐在肝组织中占有优势；但是肝外组织中的野生型HBV可以存活下来，并释放病毒颗粒感染肝脏，以维持CTL的应答；并且在这个研究中，变异仅发生在这个表位。另一个解释是由于交叉递呈机制，识别HBcAg(18-27FLPSDFFPSI)特异性的CTL也可以识别表位HBcAg(18-27FLPSDFFPSV)。 其次，我们利用流式细胞仪多色荧光标记的方法对慢性乙型肝炎患者的HBV特异性CTLs进行表型分析。三色荧光分析结果发现50％以上的HBcAg(18-27)及HBeAg(335-343)特异性CTL不表达CD28，提示HBV特异性CTL暴露在抗原刺激下，重复多轮增殖后，CD28表达逐渐丢失。另外我们发现50％左右的HBpAg(575-583)表位特异性的CTL表达CD28，这可能与乙肝病毒聚合酶抗原呈递到感染肝细胞表面较少有关，因此HBpAg(575-583)表位特异性的CTL受到的抗原刺激比HBcAg(18-27)特异性CTL及HBeAg(335-343)特异性CTL少。进一步进行四色荧光分析，结果发现HBV特异性CTLs的表型多为CD27-CD28-CD45RA-CD45RO+，表明HBV特异性CTL多处于晚期分化阶段；尽管CD28-HBV特异性CTL的表型也多为CD27-CD45RA-CD45RO+，处于晚期分化阶段，但CD45RA的表达在CD28-HBV特异性CTL明显增加，提示CD28-HBV特异性CTL中处于终末分化阶段的细胞增多。 第三，老化的CD28-T细胞表达自然杀伤细胞相关受体，本研究检测了NKRs中的三个受体即CD56、CD57和KIR在HBV特异性CTLs及CD28-HBV特异性CTLs的表达情况。结果发现慢性乙型肝炎患者外周血CD56+CD8high细胞、CD57+CD8high细胞、KIR+CD8high细胞明显增加，并且90％以上的CD56、CD57、KIR均表达于CD28-CD8high细胞；50％以上的HBV特异性CTL表达CD56、CD57，10-30％的HBV特异性CTLs表达KIR；其中有85％以上的CD56、CD57、KIR表达于CD28-HBV特异性CTLs。结果表明多数的CD28-HBV特异性CTL表达CD56、CD57、KIR，提示NKRs的表达是T细胞获得新功能的特性，并且与CD28表达丢失相关。 第四，我们用pentamer法结合胞内Bcl-2、Ki67染色检测HBV特异性CTLs的增殖和凋亡情况。结果发现70％以上的CD28-HBV特异性CTL表达Bcl-2，而75％以上的HBV特异性CTL没有表达Ki-67；表明CD28-HBV特异性CTL增殖能力下降、耐受凋亡。 最后，我们检测了慢性乙型肝炎患者CD28-HBV特异性CTLs的功能状态。本实验利用HBV抗原肽进行外周全血的活化检测IFN-γ，结果发现慢性乙型肝炎患者IFN-γ+CD8+双阳性T细胞频率低下，以致于不能检测IFN-γ+在HBV特异性CTL和CD28-HBV特异性CTL的表达情况，但是可以推测CD28-HBV特异性CTL表达IFN-γ水平很低。我们还检测了穿孔素(perforin)和颗粒酶B(GrB)的表达情况，结果发现90％的GrB表达于CD28-CD8+T细胞，85％的perforin表达于CD28-CD8+T细胞。然而利用五聚体技术结合流式多色分析却发现HBV特异性CTLs和CD28-HBV特异性CTLs表达perforin和GrB水平低下。结果提示HBV特异性CTL和CD28-HBV特异性CTL功能低下，不能有效行使其效应功能。 本研究结果显示：慢性乙型肝炎患者不表达CD28的HBV特异性CTLs数量增加，并且CD28-HBV特异性CTLs多处于晚期和终末分化阶段；绝大多数CD28-HBV特异性CTL表达NKR(CD56，CD57，KIR)；CD28-HBV特异性CTL增殖能力下降并且耐受凋亡；CD28-HBV特异性CTL表达IFN-γ、perforin、GrB水平低，细胞效应功能低下。本研究结果提示慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs处于增殖老化状态，这可能是HBV特异性CTLs功能低下的关键原因。本研究提出HBV特异性CTLs处于增殖老化状态的结论，为阐明慢性乙型肝炎免疫病理机制开辟了新思路，同时对慢性乙型肝炎的治疗具有借鉴意义。

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摘要

前言

第一部分慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL的CD28表达

第二部分自然杀伤细胞相关受体(NKRs)在HBV特异性CTLs的表达研究

第三部分HBV特异性CTL增殖情况及耐受凋亡情况

第四部分HBV特异性CTLs功能研究

全文结论

致谢

参考文献

文献综述一HBV特异性CTL在病毒清除和肝脏损伤中的作用

文献综述二免疫老化过程中T淋巴细胞增殖老化研究进展

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