丙烯酰胺亚急性染毒对断乳期大鼠海马神经元发育的影响

摘要

丙烯酰胺（ACR）是一种在工业中广泛应用的化学物质，主要用于合成聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺广泛应用于国防、石化、水处理、造纸、纺织、科研实验等多种领域。聚丙烯酰胺本身没有毒性，但ACR复合体中常常含有微量的单体，单体形式的ACR具有毒性，对人体产生一定的危害。动物实验研究表明，丙烯酰胺具有神经毒性、生殖毒性和致癌性，但只有神经毒性是在人群中发现的。目前关于丙烯酰胺的神经毒性在成年动物中有大量的报道，丙烯酰胺的神经毒性主要是引起中枢和周围神经系统的轴突病变，其毒性表现为共济失调、骨骼肌无力、体重减轻，病理特征为外周神经元轴突的肿胀、变性。课题的前期研究也证实了丙烯酰胺的神经毒性。
　　自从2002年发现多种富含糖类和天冬氨酸残基的食物在高温烹调中会通过美拉德反应产生ACR后，食材中ACR的暴露作为一种食品安全问题引起全球的广泛关注。2006年，第64届FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会指出，普通人群从食品中摄取 ACR的平均量为每天每公斤体重1μg。由于婴儿和儿童体重更轻，但消耗的零食更多，比如薯片、饼干和奶酥等，所以他们相对的ACR摄入量更高，大约是成人的2-3倍。因此，研究ACR对婴幼儿神经发育是否会造成伤害就显得十分重要，而关于ACR对胚胎期和哺乳期动物的神经元发育的影响还不清楚。为此，开展了丙烯酰胺亚急性染毒对断乳期大鼠海马神经元发育的影响的研究。
　　目的：
　　通过观察胚胎期和哺乳期暴露于丙烯酰胺的幼鼠的体重变化；HE染色观察海马齿状回神经元形态学变化；免疫组织荧光检测海马齿状回神经元DCX和SYP表达的变化；Western Blot检测海马中BDNF和GAP-43表达量的变化，来初步探讨胚胎期和哺乳期丙烯酰胺暴露对大鼠海马神经元发育的影响以及其可能的机制。
　　方法：
　　1.动物模型的建立：SPF级SD大鼠，雌雄各32只，5-8周龄，体重150-180g，随机以1:1的比例雌雄大鼠同笼交配，逐日早晨检查阴栓，查到阴栓，则确认交配成功，并定该日为妊娠第“0”天。将孕鼠随机分为四组，每组8只，于妊娠第6天开始给药，第一组母鼠的饮水中不加丙烯酰胺作为空白对照组，第二、三、四组母鼠的饮水中分别加入丙烯酰胺使其浓度为50ppm、100ppm、200ppm。连续给药至幼鼠出生后第21天（分娩当天记为出生后第“0”天）。每窝幼鼠在出生后第三天称重并都随机保留8只。
　　2.母鼠的一般生理指标检测：密切观察各组母鼠的一般状况，染毒期间每周测量各组母鼠饲料的消耗量、饮水量和体重的变化，计算出染毒期间各组母鼠丙烯酰胺的平均日摄入量。
　　3.母鼠步态评分的观测：密切观察各组母鼠神经行为的改变，染毒期间每周给出步态评分。
　　4.幼鼠的生长观测：从幼鼠出生日至断乳期，密切观察幼鼠的一般生长状况，每周为幼鼠称量一次体重。
　　5.幼鼠海马中神经元形态学观测：取断乳期幼鼠大脑组织的石蜡切片进行常规HE染色，光镜下观察海马齿状回神经元的形态学变化。
　　6.幼鼠海马中 DCX、SYP的表达：利用免疫荧光组织化学法观测各组断乳期幼鼠海马中DCX、SYP的表达情况，并对免疫荧光阳性产物进行图像分析。
　　7.幼鼠海马中BDNF、GAP-43的表达量的检测：利用Western Blot检测各组断乳期幼鼠海马中BDNF、GAP-43的表达含量。
　　8.统计学处理：实验数据采用xs表示，应用用SPSS16.0统计软件进行数据处理。母鼠步态得分用Mann Whitney UTest进行分析，其它数据采用单因素方差分析，如果差异性显著再用LSD法进行组间两两比较。检验水准α=0.05，若P<0.05，结果有统计学意义。
　　结果：
　　1. ACR对母鼠的影响：ACR染毒期间，与0ppm组相比，100ppm组和200ppm组母鼠体重减轻，饲料消耗量和饮水量有所减少，步态得分增高，染毒结束时，100ppm组和200ppm组母鼠分别呈轻度和中-重度神经受损症状。
　　2. ACR对幼鼠生长的影响：与0ppm组相比，50ppm组、100ppm组和200ppm组幼鼠出生时体重偏低，而且生长缓慢，至断乳期，50ppm组、100ppm组和200ppm组的幼鼠的体重和对照组相比明显下降（P<0.01），分别为对照组幼鼠体重的96.25％、81.07%和62.34%。
　　3.各组断乳期幼鼠海马HE染色结果：光学显微镜下观察，50ppm组幼鼠海马齿状回中神经元未见显著性变化；100ppm组幼鼠海马齿状回颗粒细胞层神经元排列较为疏松，神经元数量有所减少，颗粒细胞层及亚颗粒细胞层中可见少量神经元发生胞核固缩；与100ppm组相比，200ppm组幼鼠海马齿状回颗粒细胞层神经元排列更加疏松，亚颗粒细胞层核固缩的神经元进一步增多，神经元核固缩程度加重。
　　4.各组断乳期幼鼠海马神经元DCX和SYP的免疫荧光组织化学检测结果：DCX免疫反应阳性物质位于颗粒层以及齿状回门区的神经元胞体和轴突中，免疫反应阳性细胞多呈圆形或梭形，与0ppm组和50ppm相比，100ppm组幼鼠海马齿状回中DCX阳性神经元平均光密度值减小，差异性显著（P<0.05），200ppm组幼鼠海马齿状回中DCX阳性神经元平均光密度值减小，差异性极显著性（P<0.01）；SYP免疫反应阳性物质主要位于齿状回颗粒层中，与0ppm组相比，100ppm组幼鼠海马齿状回中SYP阳性神经元平均光密度值减小，差异性显著（P<0.05），200ppm组幼鼠海马齿状回中SYP阳性神经元平均光密度值减小，差异性极显著（P<0.01）。
　　5.各组断乳期幼鼠海马组织中BDNF和GAP-43的Western Blot检测结果：BDNF和GAP-43在各组幼鼠海马中都有阳性表达，与0ppm组和50ppm组幼鼠海马中BDNF表达量相比，100ppm组降低，差异性显著（P<0.05），200ppm组极度降低（P<0.01）；与0ppm组幼鼠海马中GAP-43表达量相比，50ppm组降低，差异性显著（P<0.05），100ppm组和200ppm组极度降低（P<0.01）。
　　结论：
　　1. ACR母源性染毒能导致幼鼠出生时体重降低，并且在哺乳期间体重生长缓慢。
　　2.胚胎期和哺乳期ACR染毒可导致幼鼠海马中DCX、SYP、BDNF、GAP-43的表达下降，并影响到海马神经元发育。
　　3. ACR亚急性染毒对断乳期大鼠海马神经元发育的影响机制可能与抑制神经元的增殖和分化及突触形成有关。

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中文摘要

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序言

材料与方法

1实验材料

1.1主要仪器和试剂

1.2实验动物

2实验方法

2.1常用试剂的配制

2.2动物造模

2.3 ACR对母鼠毒性的观测

2.4仔鼠的生长观测

2.5动物取材

2.6脑组织形态学检测

2.7海马组织Western Blot检测

2.8 统计学分析

结果

1 ACR对母鼠的影响

1.1 ACR对母鼠生理指标的影响

1.2母鼠步态评分结果

2 ACR对幼鼠的影响

2.1 ACR对幼鼠体重增长的影响

2.2各组幼鼠海马HE染色结果

2.3各组幼鼠海马的免疫荧光组织化学检测结果

2.4 各组幼鼠海马组织的Western Blot检测结果

讨论

1 ACR亚急性染毒对母鼠的影响及分析

2 ACR亚急性染毒对幼鼠体重的影响及分析

3 ACR亚急性染毒对幼鼠海马神经元发育的影响及分析

结论

参考文献

中英文缩写语对照表

综述

攻读学位期间发表的文章

致谢