FasL相互作用蛋白在结直肠癌肝转移中的作用及其意义

摘要

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中的发病率和死亡率均位居第二位。随着我国国民总体生活水平的提高，膳食结构的变化，近年结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势，虽结直肠癌诊疗技术有着长足发展，但结直肠癌的总体5年存活率并无显著提高，其原因是术后复发与肝转移，也是制约结直肠癌预后的主要因素。因此如何早期预测、早期发现、早期诊断与早期治疗结直肠癌复发与肝转移，是提高5年生存率的关键。因此深入研究结直肠癌复发与转移的机理，具有十分重要的临床意义。寻找新的、特异性强、敏感性高的诊断复发与转移的标志物，是本研究的立题依据和主要目的。 目的：利用酵母双杂交系统，在人胎肝文库中筛选并验证FasL相互作用蛋白；通过在筛选建立的结直肠癌高肝转移动物模型组织及细胞株中验证其表达规律，探讨FasL及其相互作用蛋白在结直肠癌发生、发展和在肝转移中的作用机制，为筛选结直肠癌肝转移的早期诊断分子标志物提供理论依据。 方法：扩增诱铒蛋白质粒FasL-pGBKT7，应用Western'Blot验证其在酵母AH109细胞中表达FasL蛋白。将FasL-pGBKT7质粒和人胎肝cDNA文库质粒共转化酵母AH109细胞。通过高严格性筛选，在人胎肝cDNA文库中筛选并鉴定与FasL相互作用的蛋白；通过筛选得到的结直肠癌高肝转移动物模型，比较高转移细胞COLR-1细胞与人直肠癌HR-8348细胞的肿瘤细胞学特性；用免疫组织化学方法检测FasL及相互作用蛋白在裸鼠组织标本中表达情况，比较在有无肝转移组织中这些蛋白的表达差异，证实他们在结直肠癌肝转移中的作用机制。所有数据均采用SPSS 12.0统计分析软件进行统计分析。 结果：FasL-pGBKT7在酵母细胞中没有自身激活活性，并可以稳定表达FasL蛋白。通过酵母双杂交系统筛选出4个与FasL特异性相互作用的蛋白，包括金属硫蛋白1K、1G，组织蛋白酶B，Anchor Attachment蛋白。用皮下瘤结直肠原位移植模型及肝转移灶组织块原代培养的方法，筛选出了具有肝转移潜能的结直肠癌肝转移细胞系COLR-1细胞，并比较了COLR-1细胞与结直肠癌HR-8348细胞的生长特性，体外培养显示COLR-1细胞肿瘤细胞学特性更加明显。流式细胞仪检测COLR-1细胞的增殖指数明显高于结直肠癌HR-8348细胞。应用免疫组化方法对COLR-1细胞相关分子的表达进行检测，结果表明：组织蛋白酶B在具有高转移潜能的结直肠癌细胞内高表达(82.35％)，高于未转移组(27.27％)；而FasL在二组中均高表达。应用蛋白印迹检测进一步证明FasL及组织蛋白酶B均可在COLR-1细胞中增强表达。 结论：本实验通过酵母双杂交系统验证了FasL相互作用蛋白结果的可靠性和重复性。从本实验中我们获得的FasL相互作用的四种蛋白在肿瘤复发与转移机制中均具有重要的研究价值，尤其是组织蛋白酶B和Anchor Attachmcnt蛋白更为重要，其中组织蛋白酶B在肿瘤侵袭和转移中的研究较为突出，而Anchor Attachment蛋白在结直肠癌的研究领域尚属空白。本实验证明组织蛋白酶B在动物体内可以与FasL发生相互作用，并且在具有高转移潜能的结直肠癌细胞内大量表达，说明了FasL蛋白可能直接作用于其下游蛋白，激活并引起其下游蛋白(包括组织蛋白酶B)在结直肠癌肿瘤细胞的大量表达，组织蛋白酶B然后作用于肝脏细胞基底膜成分的重要蛋白，从而促进结直肠癌细胞定向转移至肝脏，增强其侵袭及转移能力。本实验为研究结直肠癌复发与肝转移提供了重要理论依据。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前言

第一部分FasL相互作用蛋白的验证

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分结直肠癌肝转移细胞系筛选及FasL相互作用蛋白在结直肠癌肝转移组织中的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

结论

致谢

附图

参考文献

文献综述　如何研究相互作用蛋白

研究生期间撰写、发表的文章