MUC1模拟表位疫苗筛选和治疗小鼠膀胱癌效应

摘要

目的：从噬菌体随机12肽库中筛选新的MUC1的模拟表位，观察其免疫学特性，以及诱导机体产生特异性免疫应答和对小鼠膀胱癌的治疗作用。构建MUC1模拟表位原核表达载体，获得特异、纯化的模拟表位融合蛋白。本研究为研制针对MUC1为靶点的肿瘤疫苗奠定基础，为膀胱癌治疗提供新方法。 方法：1.选用抗MUC1多肽表位的单克隆抗体BC2为筛选配基，利用噬菌体展示技术，从噬菌体随机12肽库中，通过3轮生物淘洗、测定噬菌体滴度、扩增噬菌斑、挑选特异性阳性噬菌体克隆，通过ELISA实验鉴定阳性噬菌体克隆与单克隆抗体BC2结合活性；抽提阳性噬菌体克隆的插入肽ssDNA模板，测定其DNA序列，按遗传密码表推导出插入肽的氨基酸序列，同MUC1核心肽表位序列APDTR进行比较，从中选出与原表位序列不同的模拟表位。利用表位预测专用数据库SYFPEITHIdatabase进行氨基酸序列的表位预测，根据抗原肽的基序特征计算其积分，判断其与MHCⅠ类分子结合能力，合成相应的模拟表位肽，通过竞争ELISA实验判断模拟表位肽能否特异性抑制单克隆抗体BC2与MUC1抗原结合，进一步鉴定筛选出的MUC1模拟表位活性。2.利用阳离子脂质体介导转染方法，将人MUC1全长cDNA转入T739小鼠膀胱癌细胞BST739中，经G418筛选和克隆化培养，基因组PCR、RT-PCR、免疫组化、流式细胞仪从不同水平检测MUC1的表达，建立稳定表达人MUC1T739小鼠膀胱癌细胞株，观察转入人MUC1肿瘤细胞体内外生长特性和体内致瘤性。3.无菌取T739小鼠股骨和胫骨，PBS冲出骨髓细胞，红细胞裂解液裂解红细胞，按2×106/ml的细胞密度加入含有树突状细胞(DC)专用培养基塑料培养皿，同时加入细胞因子rmGM-CSF，rmIL-41000U/ml，37℃，5％CO2体外培养，第6天加入LPS(1μg/ml)刺激DC成熟，第7天收集细胞，显微镜下观察成熟DC形态，流式细胞仪检测成熟DC标记33D1单抗的表达以判断DC纯度。4.体外用合成的模拟表位肽刺激成熟DC，PBS洗涤三次，然后分别用PBS，未刺激的DC，MUC1模拟表位肽刺激的DC，通过小鼠尾静脉注射，免疫T739小鼠，每只注射2×105细胞，每周免疫一次，共三次。免疫结束后，分离小鼠血清和脾细胞，ELISA检测小鼠血清产生的模拟表位抗原特异性抗体，ELISPOT(酶联免疫斑点，Enzyme-LinkedImmunoSPOT)检测小鼠脾脏淋巴细胞产生的活化的模拟表位特异性T细胞，以免疫后的小鼠活化T细胞为效应细胞，以稳定表达人MUC1T739小鼠膀胱癌细胞为靶细胞，进一步用非放射性乳酸脱氢酶法检测不同效：靶比例时活化的模拟表位特异性T细胞体外细胞毒效应。5.取对数生长期BST739-PC、BST739-MUC1细胞，分别皮下接种T739小鼠，2×106/只，建立皮下荷瘤鼠模型，观察小鼠肿瘤生长情况，行免疫组织化学检测肿瘤组织中MUC1表达及其分布特点。6.T739小鼠随机分为4组，首先用BST739-MUC1细胞，分别皮下接种T739小鼠，2×106细胞/只，7天后第1组相同区域皮下注射等渗盐水0.2ml，第2组注射没有肽刺激的空DC细胞悬液，第3组注射负载13号MUC1模拟表位肽的DC细胞悬液，第4组注射负载14号MUC1模拟表位肽的DC细胞悬液，2×105/只，1周后加强免疫1次，建立T739小鼠膀胱癌治疗模型。治疗过程中，每1～2日测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，治疗2周后，切取瘤组织称瘤重，并观察剩余小鼠存活期。7.依据模拟表位基因序列，选取Ecoli大肠杆菌偏好密码子合成目的基因片段，合成目的基因片段进行自连，选用最大重复序列目的片段克隆入PET-31b(+)高效表达载体，克隆PCR和测序鉴定，选用插入最大目的片段的重组质粒进一步转化表达宿主菌BLR(DE3)plysS，用IPTG进行诱导表达，并对表达条件进行优化，以获得融合蛋白的高效表达，用Ni2+亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，收集纯化蛋白样品，Western印迹鉴定。 结果：1.从噬菌体随机肽库中筛选获得两个MUC1的模拟表位，能特异性与单克隆抗体BC2结合，同MUC1核心肽表位序列APDTR进行比较，无同源性，表位预测显示13号肽序列包含有与HLA-B*0702、HLA-B*08等MHCⅠ类分子较好结合的表位，14号肽序列包含有与HLA-A*0201、HLA-B*5101等MHCⅠ类分子较好结合的表位，预测分值均较高。合成的模拟表位肽能竞争抑制MUC1单克隆抗体与MUC1抗原的结合，两个肽浓度为50ug/mL时几乎完全抑制抗原抗体结合。2.建立稳定表达人MUC1的T739小鼠膀胱癌细胞株，基因组PCR、RT-PCR、免疫组化、流式细胞仪从DNA、mRNA和蛋白质水平证实人MUC1基因整合在细胞基因组中并稳定表达MUC1，MUC1主要表达于胞膜和胞浆，与亲代细胞相比，BST739-MUC1体外生长特性无明显改变。3.从T739小鼠骨髓细胞中诱导、培养出成熟DC，光镜下观察培养7天的成熟DC，可见具有典型的DC形态，流式细胞仪鉴定其纯度为78.8％。4.ELISA检测结果显示两个肽免疫的T739小鼠血清产生的特异性抗体活性明显高于两个PBS和DC+PBS免疫后小鼠，相差非常显著(p＜0.01)，表明两个肽免疫的T739小鼠体内产生了MUC1特异性抗体。ELISPOT结果显示，两个肽免疫的T739小鼠特异性分泌IFN-γ的T细胞频数分别是92±10.5、106.5±12.8，而PBS和DC+PBS免疫后小鼠特异性分泌IFN-γ的T细胞频数均少于10，数量明显少于前两个组，表明两个肽免疫的T739小鼠脾脏细胞中，产生了特异性活化的T淋巴细胞。活化的脾脏淋巴细胞的细胞毒效应检测显示效靶比为25∶1开始显示溶破效应，当效靶比为100∶1时两个肽免疫的T739小鼠产生的活化T淋巴细胞具有显著细胞毒功能，与PBS和DC+PBS免疫小鼠相比，相差非常显著(p＜0.01)。5.两组小鼠背部皮下注射BST739-PC细胞或BST739-MUC1细胞7天左右所有T739小鼠均生长出皮下肿瘤，成瘤率100％，两组肿瘤生长情况无明显差别，第30天以后小鼠开始陆续死亡，接种BST739-MUC1小鼠平均生存时间稍长于接种BST739小鼠。免疫组化检测结果同培养的转染BST739-MUC1细胞和BST739-PC细胞免疫组化检测结果一致。6.在T739小鼠膀胱癌治疗模型中，治疗前各组之间的瘤体积大小基本保持一致，治疗1周后，第1-4组肿瘤平均体积分别是690.7231±66.9365mm3，766.4980±150.7123mm3，514.8932±140.8419mm3，474.1843±81.5392mm3，与DC+PBS组和PBS组相比，以DC+肽免疫的两组小鼠瘤体积开始缩小，治疗2周后，第1-4组肿瘤平均体积分别是2440.318±110.2717mm3，2361.863±265.4752mm3，1277.716±94.0457mm3，1043.940±72.8229mm3，两组DC+肽免疫的小鼠瘤体积减小更加明显，与DC+PBS组和PBS组相比差异非常显著(p＜0.01)。治疗2周后，第1-4组平均瘤重分别为2.942±0.34克，3.162±0.225克，1.728±0.295克，1.408±0.215克，1、2组与3、4组相比差异非常显著(p＜0.01)，第2-4组抑瘤率分别为6.96％、41.26％、52.14％，第1-4组荷瘤鼠的生存期分别为34.6±3.507天，35.2±3.564天，58.4±5.595天，59±6.819天，DC+肽免疫的两组荷瘤小鼠生存期较PBS+DC组和等渗盐水组明显延长，差异有显著性意义(p＜0.01)。7.磷酸化的目的基因片段直接退火自连后，凝胶电泳鉴定至少连上2个重复序列。PET-31b(+)质粒去磷酸化并酶切，用最大重复序列目的片段与PET-31b(+)载体连接，克隆PCR和测序结果说明有两个目的片段插入重组质粒载体，选用此重组质粒进一步转化高效表达菌BLR(DE3))plysS，在0.1mMIPTG，30℃，诱导3小时后，蛋白电泳见可13号和14号两个MUC1模拟表位融合蛋白表达，表达蛋白的分子量与理论值(18×103D)相符，在0.5mMIPTG，37℃，诱导4-6小时，MUC1模拟表位融合蛋白在包涵体内可得理想表达。用Ni2+亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，15％SDS-PAGE电泳结果可见清晰特异性蛋白条带，Westernblot检测，MUC1模拟表位显色条带与SDS-PAGE电泳图纯化蛋白位置相对应，证明所表达蛋白的特异性，并具有良好的抗原性。 结论：筛选到两个MUC1的模拟表位，建立了稳定表达人MUC1的小鼠膀胱移行细胞癌细胞株及相关肿瘤模型。负载两个模拟表位肽的DC免疫小鼠，体内外均可诱导机体产生特异性细胞和体液免疫应答，在T739小鼠膀胱癌治疗模型中能明显抑制肿瘤生长，显著延长T739荷瘤小鼠生存时间。成功构建了两个MUC1的模拟表位原核表达载体，获得了具有抗原特性的纯化的MUC1模拟表位融合蛋白；为进一步研究MUC1模拟表位在肿瘤免疫治疗方面的应用奠定基础。

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摘要

前言

第一部分MUC1黏蛋白模拟表位的筛选和鉴定

第二部分MUC1模拟表位肽免疫活性及治疗小鼠膀胱癌研究

第三部分MUC1模拟表位的克隆和原核表达

全文结论

致谢

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文献综述一MUC1在泌尿系肿瘤的应用

文献综述二针对MUC1的DC疫苗的研究进展

研究生期间发表文章