HIF-1α和COX对大鼠缺血组织血管生成和内皮祖细胞动员的影响研究

摘要

1.背景与目的： 随着人们生活水平的提高，冠心病的发病逐年增多，已成为威胁人类健康的主要疾病，冠心病的治疗已从单纯的药物治疗，发展到外科手术、冠脉介入等多种治疗手段，但远期疗效还不理想，对已坏死或凋亡心肌的治疗目前尚无有效治疗手段。最近细胞移植和冠脉血管再生治疗成为了冠心病治疗的新方法，对坏死、凋亡的心肌的修复取得了初步的疗效，成为目前研究的热点。 有研究发现急性心肌缺血可导致循环血内皮祖细胞(EPCs)增加，且这些细胞可以向缺血心肌归巢，在缺血局部促进心肌和血管再生，减少心肌细胞因缺血导致的坏死和凋亡，从而改善心脏功能，减少死亡率；EPCs的移植还加速损伤血管内皮修复、减少内膜增生和预防血管狭窄。虽然EPCs移植治疗冠心病的研究已开始进入临床试验，且初步的实验证实这种治疗方法有效，但目前要获得足够的EPCs用于治疗还比较困难，并且这种缺血导致的骨髓EPCs的动员和向缺血心肌的归巢机制尚不清楚，EPCs治疗起效的确切机制还有争议。弄清这种动员、归巢机制对冠心病的细胞移植治疗有重大意义。 缺氧诱导因子(HIF-1)是一种缺氧诱导的DNA结合蛋白，它是由120KD的α亚基和91-94KD的β亚基组成的异二聚体，两者都属BHLH-PAS家族蛋白，HIF-1α是它的诱导型，HIF-1β是它的结构型，在缺氧过程中主要是HIF-1α起作用。研究发现在人体许多组织缺血缺氧时，可诱导组织HIF-1α表达的增加，缺氧诱导HIF-1α表达的增加是机体对缺氧的一种适应性反应。HIF-1α又可对其靶基因，如促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因的转录进行调节，从而发挥调节红细胞的生存、血管新生、能量代谢、激素代谢等多方面功能。已有研究发现VEGF、EPO、NOS对骨髓EPCs的动员、归巢有作用。因此我们推测缺血可能通过诱导HIF-1α的表达，然后作用于EPO，VEGF基因，从而诱导骨髓EPCs的动员和向缺血区归巢，HIF-1α在缺血诱导骨髓EPCs的动员和归巢中可能起重要作用。 环氧化酶(COX)是催化花生四烯酸向血栓烷A2(TXA2)和前列腺素转化的限速酶，有两种酶形式即结构型环氧化酶-1(COX-1)和诱导型环氧化酶-2(COX-2)。COX-1存在于各种组织中，主要催化花生四烯酸转化为TXA2，而COX-2催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质，它可以被自由基、生长因子和细胞因子诱导产生。TXA2是一血管收缩剂，可促进血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集，而前列腺素类物质可抑制血小板的聚集，增加内皮一氧化氮合成酶(eNOs)的活性，诱导一氧化氮(NO)、VEGF的生成，有扩张血管、抗氧化和抗血管平滑肌细胞增殖作用，也有促进内皮细胞增殖作用。 在对肿瘤、消化性溃疡及缺血性眼底血管生成疾病的研究中发现：COX-2的高诱导可促进血管生成，而COX-2抑制可以抑制肿瘤及溃疡的血管生成，研究还证实阿司匹林减少血液中的VEGF。因此，COX抑制剂包括阿司匹林因抑制COX-2已试用于抗肿瘤的血管生成治疗。作为心血管疾病的一级和二级预防的基础药物阿司匹林以其抑制COX-1而起抗血小板的聚集作用、预防冠脉血栓形成、降低了心血管不良事件的发生，但它的COX2抑制作用、减少血中VEGF的作用、抑制血管生成作用是否也会抑制缺血心肌的血管生成，对EPCs的动员是否也有不良的作用呢?目前还不清楚。最近，COX-2抑制剂对心血管疾病患者的不良作用也得到证实，但其原因也不很清楚。 综上所述，我们认为1)HIF-1α在缺血诱导骨髓EPCs的动员和归巢中可能起重要作用。2)选择性抑制COX-1用于抗血小板治疗可能对冠心病更有利，3)COX-2可能通过对VEGF的作用而影响心肌血管生成和EPCs的骨髓动员和活性。4)由于HIF-1α与COX-2都共同影响VEGF，因此HIF-1α与COX-2可能有相互作用。 本研究拟在大鼠下肢和心肌缺血动物模型的基础上，通过反义寡核苷酸技术干预HIF-1α的基因表达和选择性COX1和COX2抑制剂分别抑制COX1和COX2以探讨HIF-1α和COX在缺血组织毛细血管生成和组织缺血时EPCs动员、归巢中的作用及可能机制。 2.方法 本研究分四部分，第一部分用HIF-1α反义寡核苷酸抑制下肢缺血大鼠缺血组织的HIF-1α的表达，探讨HIF-1α在大鼠缺血下肢血管生成及EPCs的动员中的作用：建立下肢缺血动物模型，分HIF-1α反义寡核苷酸组和HIF-1α错义寡核苷酸组及对照组，分别给予相应的干预，测定各组缺血组织HIF-1α的表达变化、毛细血管的密度、循环血EPCs和血浆VEGF。第二部分通过体外细胞共培养迁移实验和细胞标记在体示踪实验，用HIF-1α反义寡核苷酸抑制缺血组织和细胞的HIF-1α的表达和氯化钴致细胞缺氧诱导HIF-1α的表达，观察HIF-1α在心肌缺血时EPCs归巢中的作用。第三部分建立急性心肌缺血模型，给予不同剂量的阿司匹林干预，测定循环血EPCs、血浆VEGF水平和缺血心肌毛细血管密度，以观察不同剂量阿司匹林对缺血心肌毛细血管生成、心肌缺血时EPCs动员和血浆VEGF的影响，从而了解环氧化酶在缺血EPCs动员及心肌血管生成中的作用。第四部分建立急性心肌缺血模型给予选择性COX1和COX2抑制剂干预，测定各干预组的循环血EPCs、血浆VEGF、缺血心肌毛细血管密度，HIF-1α的表达，进一步观察环氧化酶在EPCs动员和缺血心肌血管生成中的作用机制及与HIF-1α的关系。 3.结果 1).HIF-1α反义寡核苷酸抑制大鼠缺血下肢血管生成及EPCs的动员：HIF-1α反义寡核苷酸组的HIF-1αmRNA和VEGFmRNA及其蛋白表达均较单纯缺血组和错义寡核苷酸组明显减少；HIF-1α反义寡核苷酸组的循环血EPCs、血浆VEGF及缺血区肌肉组织毛细血管密度均较单纯缺血组和错义寡核苷酸组明显减少，其余两组间比较无显著性差异。 2).HIF-1α在EPCs向缺血心肌归巢中的作用：培养的心肌细胞与EPCs在Boyden小室共培养趋化实验发现，氯化钴化学缺氧诱导HIF-1α表达的心肌细胞明显增加EPCs向其趋化，而在先加HIF-1α反义寡核苷酸处理后，这种氯化钴化学缺氧诱导心肌细胞HIF-1α表达明显减少，EPCs向其趋化也明显减少。在体实验也发现缺血局部反义寡核苷酸抑制了HIF-1α表达，acLDL-DiI标记的EPCs体内示踪发现在该组中荧光面积明显减少。 3).阿司匹林对大鼠缺血心肌血管生成及EPCs动员的影响：单纯心肌缺血组、假手术组与正常对照组相比，血浆VEGF和循环血EPCs显著增多；心肌缺血加小剂量阿司匹林组与正常对照组相比，循环血EPCs显著增多；单纯心肌缺血组与正常对照组相比，毛细血管密度显著增加；大剂量阿司匹林抑制了因缺血导致的VEGF、EPCs和毛细血管密度的增加。 4).环氧化酶在大鼠缺血心肌血管生成及EPCs动员中的作用及机制：心肌缺血加选择性COX2抑制剂罗非昔布组与单纯心肌缺血组、心肌缺血加选择性COX1抑制剂VS组比较，血浆VEGF、循环血EPCs、缺血心肌毛细血管密度和HIF-1αmRNA表达均显著减少(p＜0.05)；其余两组比较无显著性差异。 4.结论 1.HIF-1α与组织缺血时的EPCs的动员和EPCs向缺血区归巢有关，其机制可能是其直接作用或通过调节VEGF起作用，HIF-1α是缺血时EPCs的一个动员因子。 2.HIF-1α反义寡核苷酸抑制缺血组织的血管生成，因此HIF-1α有促缺血组织的血管生成作用。 3.大剂量的环氧化酶抑制剂阿司匹林抑制心肌缺血时的EPCs的动员和心肌血管生成，可能是大剂量时主要通过抑制环氧化酶2，从而抑制缺血心肌HIF-1α的表达及血浆VEGF而起作用的。4.环氧化酶抑制剂对心肌缺血时EPCs动员和心肌血管生成的抑制作用是主要通过对环氧化酶2的抑制起作用的。 5.环氧化酶2抑制剂抑制缺血心肌HIF-1α的表达及血浆VEGF浓度。

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摘要

前言

第一部分HIF-1α反义寡核苷酸对大鼠缺备下肢血管生成及EPCs动员的影响

第二部分 HIF-1α在内皮祖细胞向缺血细胞和组织归巢中的作用

第三部分阿司匹林对大鼠缺血心肌血管生成及内皮祖细胞动员的影响

第四部分环氧化酶在大鼠缺血心肌血管生成及内皮祖细胞动员中的作用

全文结论

致谢

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参考文献

文献综述 环氧化酶、环氧化酶抑制与心血管疾病

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