整合素连接激酶在结肠癌细胞群集耐药中的作用

摘要

背景与目的： 肿瘤耐药是导致化疗效果不佳的主要原因，群集耐药现象已经在许多肿瘤细胞的耐药实验中得到证实，但群集耐药的机制尚不十分明确。ILK作为连接细胞与细胞外基质的关键因子，被认为是体内多种信号传导通路的关键点。研究表明，ILK参与了多种肿瘤细胞增殖、粘附、迁移和侵袭，并能抑制肿瘤细胞的凋亡，在肿瘤耐药中可能发挥重要作用。本研究拟建立结肠癌HT29细胞多细胞球培养模型，通过构建能表达小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)的质粒载体，以抑制ILK表达，进而检测对HT29细胞体外增殖、凋亡及群集耐药的影响。 研究方法： 采用人结肠高分化腺癌细胞株HT29为研究对象，用liquidoverlaytechnique进行三维(three-dimensionalculture，3D)培养法建立HT29多细胞球模型。设计和构建能表达针对ILKmRNA的siRNA的RNA干扰载体和表达不针对任何已知人类mRNA的siRNA的RNA干扰阴性对照载体，分别通过脂质体介导转染至结肠癌HT29细胞。经G418筛选(1000μg/mL)并稳定传代后，用半定量RT-PCR、Westernblot检测未转染质粒的HT29细胞、转染了ILK干扰载体的HT29细胞和转染了阴性对照载体的HT29细胞中ILKmRNA和蛋白表达，筛选ILK表达受抑制的HT29细胞(HT29/siILK)和ILK表达未受影响的RNA干扰阴性对照HT29细胞(HT29/Control)。针对体外培养的HT29细胞、HT29/siILK细胞和HT29/Control细胞三组细胞，分别采用MTT、细胞计数法检测细胞增殖及对奥沙利铂的药物敏感性；Tunel法检测细胞凋亡。 结果： 1、成功建立了HT29多细胞球培养模型。倒置显微镜观察，细胞聚集成团，排列紧密。2、HT29多细胞球表现出群集耐药性。HT29多细胞球对奥沙利铂的药物敏感性显著低于HT29单层细胞。HT29多细胞球在奥沙利铂浓度为50μg/ml、100μg/ml时的生存分数(x±s)分别为0.797±0.004，0.715±0.017，HT29单层细胞则分别为0.565±0.014、0.425±0.032；二者有显著性差异(P＜0.05)。3、Westernblot方法检测HT29多细胞球中ILK蛋白的表达明显高于单层培养的HT29细胞。4、成功构建针对ILK的特异性RNAi载体，并稳定转染HT29细胞。通过RT-PCR方法检测HT29/siILK组细胞ILKmRNA的表达(0.16±0.11)显著低于HT29/Control组(0.53±0.10)细胞(P＜0.05)，Westernblot方法亦证明HT29/siILK组细胞的ILK蛋白表达显著低于HT29组细胞和HT29/Control组细胞(P＜0.05)。提示通过RNA干扰方法能有效地抑制HT29细胞的ILK表达。5、通过MTT法做细胞生长曲线得知，HT29/siILK细胞增殖活性明显低于HT29细胞。HT29/siILK多细胞球在奥沙利铂浓度为100μg/ml时，生存分数为0.525±0.054，与单层培养的HT29细胞无显著差异，说明ILK在HT29细胞群集耐药中有重要作用。6、Tunel法检测ILK对HT29细胞凋亡的影响：HT29/siILK细胞凋亡率明显增加，与HT29细胞比较存在显著差异(P＜0.05)，HT29/Control细胞与HT29细胞相比无明显差异(P＞0.05)。 结论： 1、在结肠癌细胞HT29、SW480、LOVO中，ILK表达水平均较高，其中在HT29细胞中表达最高；成功建立了能够较好模拟体内实体瘤的结肠癌HT29多细胞球培养模型。 2、构建了针对ILK基因的特异性RNAi质粒载体，可稳定、有效地沉默结肠癌HT29细胞的ILK基因的表达。 3、抑制ILK基因的表达，能有效抑制结肠癌HT29细胞的增殖，促进其凋亡，并能促进奥沙利铂诱导的HT29细胞的凋亡。 4、抑制ILK的表达，可以增加结肠癌HT29多细胞球的药物敏感性，提示其在肿瘤群集耐药中发挥重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分ILK在结肠癌细胞中的表达及结肠癌多细胞球培养模型的建立

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、小结

第二部分ILK特异性siRNA表达载体的构建、鉴定及干扰效率的检测

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、小结

第三部分沉默ILK对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡及细胞群集耐药的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、小结

全文结论

致谢

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参考文献

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