人增生性瘢痕成纤维细胞P物质表达及其对胶原合成的影响

摘要

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是局限于皮肤伤区范围之内的纤维组织过度增生，常见于深Ⅱ度、Ⅲ度皮肤烧伤创面。成纤维细胞(fibroblast，Fb)的异常增殖及胶原(collagen)合成增加和过度沉积是增生性瘢痕的病理特征。目前对其发病机制仍不清楚，一般认为胶原合成的主要细胞一成纤维细胞的功能异常与其自分泌的某些因子、蛋白关系密切。如由增生性瘢痕成纤维细胞自分泌的转化生长因子-α、β(transforminggrowth factor-α、β,FGF-α、β)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-binding proteins,IGFBPs)的调控模式不同于正常皮肤，由此影响了增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成。 P物质(substance P，SP)是目前发现最早、功能复杂的神经肽，它不仅存在于中枢、外周神经系统，成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞(单核/巨噬细胞、肥大细胞)等不仅有P物质受体，还可合成、分泌P物质。成纤维细胞自分泌SP受胞外SP的调控。如以大剂量辣椒素耗竭感觉神经末梢，阻断神经末梢释放SP后，致伤鼠皮肤伤区肉芽组织成纤维细胞SP表达较未用辣椒素致伤鼠明显减弱；10<'-8>mol/LSP加入正常皮肤成纤维细胞的培养液后1-3h，成纤维细胞的SP基因和蛋白表达迅速上调。近来的研究证实，SP是组织修复的重要调控因子。皮肤损伤时感觉神经末梢释放的SP不仅可启动神经源性炎性反应，同时可诱导成纤维细胞内多种细胞因子(如TGF-β、EGF、TNF)表达增多，直接或间接促进成纤维细胞增殖。 已知增生性瘢痕组织中SP含量明显较正常皮肤组织高，但目前尚不明确增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast，HSF)SP表达水平与正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblast，NSF)相比有何特点，细胞外SP对其表达有何影响，SP在增生性瘢痕胶原合成中有何作用?针对上述问题开展研究，无疑将丰富增生性瘢痕成纤维细胞异质性理论，同时可以为增生性瘢痕治疗提供新的思路。 为探讨增生性瘢痕成纤维细胞SP表达的特点及其对胶原合成的影响，本研究采用体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞为对象，以培养的正常皮肤成纤维细胞为对照，利用RT-PCR和酶联免疫吸附检测(ELIsA)技术，分别从mRNA和蛋白两个水平检测增生性瘢痕成纤维细胞SP的表达。在此基础上，分别用10<'-7>mol/L(低浓度)和10<'-5>mol/L(高浓度)SP以模拟不同胞外SP浓度刺激培养的增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞，观察两种成纤维细胞SP表达的时效特点，以此分析细胞外SP对增生性瘢痕成纤维细胞SP表达的影响。为了解成纤维细胞自分泌SP在胶原合成中的作用，以SP受体阻断剂(WIN62577)特异阻断培养的增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞SP受体NK-1R(Neurokinin 1 receptor)后，采用放射示踪法检测3H一脯氨酸掺入及免疫细胞化学结合图像分析技术，分析NK-1R阻断后成纤维细胞胶原合成的变化。 结果如下： 1、体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的鉴定及SP表达情况 (1)体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞呈长梭形，波形蛋白(+)，α-平滑肌肌动蛋白(一)，确定为实验所需的成纤维细胞。 (2)体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞内SP mRNA表达明显高于正常皮肤成纤维细胞，其SP蛋白表达量为0.132±0.026nmol/L，而正常皮肤成纤维细胞SP蛋白表达量为0.056±0.022nmol/l，两者之间差异显著(P<0.05)。 2、外源性SP对增生性瘢痕成纤维细胞SP表达的影响 采用不同浓度的SP刺激体外培养的增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞后，发现成纤维细胞SP mRNA和蛋白表达均明显上调，但增生性瘢痕成纤维细胞在达到峰值的时相、升高的幅度、峰值均明显不同于正常皮肤。 (1)成纤维细胞SP mRNA表达10<'-7>mol/LSP刺激后，增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞SP mRNA表达受SP刺激后均出现上调，分别在刺激后6h、3h达到高峰，随后缓慢下降。10<'-5>mol/LSP刺激后，增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内SP mRNA在刺激后3h、6h达到高峰，增生性瘢痕成纤维细胞峰值高于正常皮肤。两种浓度刺激后24h增生性瘢痕成纤维细胞SP mRNA均高于正常皮肤成纤维细胞。 (2)成纤维细胞SP蛋白表达10<'-7>mol/L SP刺激后，增生性瘢痕成纤维细胞SP蛋白表达在刺激后6h达到高峰，达到0.367±0.026nmol/L，升高了225％，随后缓慢下降，刺激后24h为0.224±0.014nmol/L，仍高于未刺激瘢痕成纤维细胞，两组相差非常显著(P<0.01)。正常皮肤成纤维细胞SP蛋白表达在刺激后3h达到高峰，达到0.489±0.022nmol/L，升高了823％，刺激后24h为0.163±0.015 nmol/L，高于未刺激正常皮肤成纤维细胞(P<0.01)。10<'-5>mol/L SP刺激后，增生性瘢痕成纤维细胞SP蛋白在刺激后3h达到高峰，达到1.476±0.068nmol/L，较刺激前升高了834％，随后迅速下降，刺激后24h为0.248±0.031 nmol/L，仍高于未刺激瘢痕成纤维细胞(P<0.01)。10<'-5>mol/LSP刺激后，正常皮肤成纤维细胞SP蛋白在刺激后6h达到高峰，达到1.257±0.086nmol/L，升高了1805％，刺激后24h为0.196±0.024 nmol/L，高于未刺激正常皮肤成纤维细胞(P<0.01)。 (3)与正常皮肤成纤维细胞相比，10<'-7>mol/L或10<'-5>mol/L SP刺激下增生性瘢痕成纤维细胞SP mRNA和蛋白表达的峰值、达到峰值时相均有明显差异(P<0.05或P<0.01)，且刺激后24h增生性瘢痕成纤维细胞SP表达水平均高于正常皮肤成纤维细胞。 3、SP对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响。 (1)增生性瘢痕成纤维细胞<'3>H-脯氨酸掺入闪烁点计数为82.13±9.23 cpm/1000细胞，显著高于正常皮肤成纤维细胞(35.7±9.8 cpm/1000细胞)(P<0.01)。 加入NK-1R阻断剂后，增生性瘢痕成纤维细胞<'3>H-脯氨酸掺入闪烁点计数为36.75±5.83cpm/1000细胞，明显低于未阻断的对照组，阻断率达到55.25％，组间差异非常显著(P<0.01)。正常皮肤成纤维细胞NK-1R阻断后，<'3>H-脯氨酸掺入闪烁点计数为24.48±3.48cpm/1000细胞，低于未阻断的对照组(35.7±9.8 cpm/1000细胞)，阻断率为31.43％，组间差异非常显著(P<0.01)。 (2)加入NK-1R阻断剂后，免疫组化半定量分析结果示，Ⅰ型前胶原的平均灰度值为102.18±15.26，Ⅲ型前胶原的平均灰度值为111.53±14.79，均明显低于未阻断对照组(P<0.01)，阻断率分别为33.35％、21.67％。 结论： 1、增生性瘢痕成纤维细胞SPmRNA和蛋白表达均明显高于正常皮肤成纤维细胞，这可能是增生性瘢痕组织中SP含量高的原因之一。 2、外源性SP对增生性瘢痕成纤维细胞P物质表达的影响不同于正常皮肤成纤维细胞。10<'-7>mol/L 或10<'-5>mol/L SP作用于增生性瘢痕成纤维细胞，其SP基因、蛋白表达升高时相点、峰值均与正常皮肤成纤维细胞有显著差异，且刺激后24h增生性瘢痕成纤维细胞SP表达水平均高于正常皮肤成纤维细胞。表明增生性瘢痕成纤维细胞功能异质性明显，其SP基因、蛋白表达与正常皮肤成纤维细胞有明显差异。SP自分泌的

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

第一部分人增生性瘢痕成纤维细胞P物质表达特点

前言

实验一P物质在体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞中的表达

材料和方法

结 果

讨论

结论

实验二外源性P物质对增生性瘢痕成纤维细胞P物质表达的影响

材料和方法

结 果

讨论

结论

第二部分P物质在增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用

前言

材料和方法

结 果

讨论

结论

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述：神经肽P物质与增生性瘢痕

研究生期间撰写和发表文章