人iASPP全长CDS的发现、克隆、表达载体构建及功能鉴定

摘要

p53是最重要的抑癌基因之一。新发现的ASPP(Apoptosis stimulating protein ofp53)家族是能特异性地调节p53抑癌功能的蛋白质。其中iASPP(inhibitory member ofthe ASPP family)是最近发现的能特异抑制p53抑癌功能的蛋白，iASPP与p53结合能干扰p53的诱导细胞凋亡能力，因此是p53的重要抑制蛋白。现已在多种肿瘤细胞中发现iASPP过高表达的现象，提示抑制iASPP的高表达有可能成为恢复p53抑癌功能的新策略。最初报导的iASPP长度为351个氨基酸，但我们最初的克隆实验发现编码351个氨基酸的iASPP(1056 bp)并不是全长iASPP基因，经过生物信息学比对得到iASPP的全长基因的CDS应为2487 bp，原来报导的短iASPP可能是全长iASPP的变种或截短形式。由于以前的研究都是基于短的iASPP序列进行的工作，而全长iASPP才是体内的主要存在形式，因此有必要对全长iASPP的功能进行研究，而克隆全长iASPP基因是功能研究的基础。本实验利用RT-PCR、PCR的方法分段扩增了全长iASPP基因，同时构建了iASPP的真核表达载体，并将其通过脂质体转染到肿瘤细胞株中，经过RT-PCR和Western Blot等方法观察阳性质粒对iASPP mRNA及蛋白表达的影响，最后检测了转染iASPP质粒前后肿瘤细胞株凋亡的变化。为进一步研究全长iASPP的功能奠定了基础。 方法： 1．培养人白血病细胞株HL-60，并提取其总DNA、RNA。根据GenBank中iASPP的序列，设计特异性引物，应用RT-PCR和PCR的方法分三段扩增iASPP基因，将三段基因拼接成全长的iASPP基因，测序。 2．在全长的iASPP基因两侧加入酶切位点Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ，克隆至pMD19-T载体，并亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP。 3．用脂质体将测序正确的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP转染至结肠癌细胞株SW480、lovo中，用RT-PCR、Western Blot方法检测iASPP的表达以及用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况。 结果： 1．用PCR技术克隆短iASPP时，测序后发现有三个位点与报导的序列不一致，重复实验结果证明确实有三个位点与原序列不同。当使用生物数据库Blast比对时，发现有许多克隆片断与我们得到的的序列重叠部分是完全一致的，从而确认了正确的全长iASPP序列。 2．为了克隆全长iASPP,首先经PCR和RT-PCR获得了iASPP的三个片断，经测序与目的序列一致；将三个片断拼接后获得一个长2516bp的片断，经测序与目的序列完全一致。 3．克隆得到质粒pMD19-T-iASPP,经酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)，构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP，经酶切测序与GenBank上登陆的人iASPPcDNA序列(gi 60457962)完全一致。 4．经pcDNA3.1(+)-iASPP质粒转染的结肠癌细胞株SW4.80、lovo的mRNA和蛋白表达均增高，细胞凋亡率下降。 结论： 1．发现人体内iASPP存在着不同长度的形式，以前研究的短iASPP可能是全长iASPP的变种或截短形式。 2．成功扩增人iASPP全长基因，重组人iASPP全长CDS克隆成功，并成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP。 3．重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP在结肠癌细胞株SW480、lovo中获得了表达。 4．转染重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP后的结肠癌细胞株SW480和lovo凋亡率下降，证明全长iASPP有抑制p53的诱导细胞凋亡的能力。提示抑制iASPP高表达有可能成为恢复p53抑癌功能的新策略。

目录

论文说明：英文缩写索引

声明

摘要

前言

第一部分iASPP全长CDS的发现、克隆及真核表达载体的构建

实验材料、设备及试剂

实验方法

实验结果

讨论

第二部分pcDNA3.1(+)-iASPP质粒转染后在结肠癌细胞株中的表达及干扰效果的鉴定

实验材料、设备及试剂

实验方法

实验结果

讨论

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述ASPP和肿瘤

研究生期间发表的文章