半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞

摘要

从母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断是近年来无创性产前诊断的研究热点，这些细胞包括滋养层细胞、淋巴细胞、颗粒细胞和有核红细胞。目前的研究认为，胎儿有核红细胞是用于产前诊断最理想的细胞。 胎儿有核红细胞的细胞膜表面表达胎儿细胞特异性抗原，为各种分离和富集技术提供了靶点。但由于母血中的胎儿有核红细胞数量极少，因此，采用何种技术或方法对母体外周血中的胎儿有核红细胞进行高效和快速的分离与富集，成为能否将无创性产前诊断在临床上推广应用的关键所在。 一、研究目的 1．建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的方法。 2．建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应场所。 3．优化半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应条件：半乳糖选择N-乙酰半乳糖，植物血凝素选择大豆凝聚素。 4．半乳糖特异性植物血凝素和流式细胞技术分离和富集FNRBCs，两种方法的对比分析。 二、材料方法 1．半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应体系的建立。 2．半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应场所的建立与应用。 3．样本选用38-40孕周正常分娩的健康产妇的胎儿脐血，经密度梯度离心法收集富含FNRBCs的胎儿有核细胞层。 4．半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的反应条件优化。 5．半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统中分离和富集到的FNRBCs的检测。 6．用转铁蛋白受体(transferrinreceptor,CD71)和HbF荧光抗体染色后做流式细胞计数，与半乳糖特异性植物血凝素分离和富集FNRBCs方法做比较。 三、主要结果 1．初步构建了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统，并通过实验证实了该反应体系能够有效分离和富集胎儿有核红细胞。 2．完成了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的反应场所-玻片池的制备、优化、回收，通过实验证实该反应场所适合分离和富集胎儿有核红细胞。 3．半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的反应条件优化。 4．实验组中，通过特异HbF荧光抗体双标染色的研究结果表明：采用浓度100μg/ml的GalNAc包被玻片后，当SBA浓度10μg/ml时FNRBCs与有核细胞的比率2.34±0.48％，当sBA浓度20μg/ml时FNRBCs与有核细胞的比率6.54±0.56％，每组结果数据以。X+S表示，经SPSS13.0软件进行两独立样本t检验，P<0.05，差异有统计学意义，通过对两种染色结果的误差限图分析，发现特异性荧光染色鉴别的误差范围小于瑞氏染色鉴别结果。 5.用CD71和HbF荧光抗体标记后，流式细胞计数结果表明：在相同的反应条件下，CD71染色标记后流式细胞计数结果3.03±1.41％，HbF染色标记后流式细胞计数结果4.73+2.51％，两组数据经SPSS13.0软件分析差异无统计学意义(P>0.05)。 四、讨论 目前，母体外周血中FNRBCs的分离和富集技术包括荧光激活细胞分类法(fluorescence activated cell sorting，FACS)、磁激活细胞分类法(magnet activated cellsorting，MACS)和电荷流式分离(flow cytosorting，CFS)等。已有报道指出大豆凝集素(SBA)是一类可特异性识别和结合半乳糖糖链的植物血凝素。以SBA为代表的植物血凝素可特异性识别和结合血细胞膜表面糖链，由于不同类型的血细胞表面的糖链数量和密度差异大，SBA与不同类型的血细胞的亲和力差异也很大，而FNRBCs表面的半乳糖分子密度高于其它有核细胞。本实验成功设计出了半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的反应体系，并证实该反应体系能够有效从新鲜脐血中分离和富集胎儿有核红细胞。 由于

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摘要

前 言

第一部分半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞系统的构建

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第一部分照片

参考文献

第二部分检验分离和富集胎儿有核红细胞的效率情况及流式细胞计数对照

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第二部分照片

参考文献

全文总结

展 望

致 谢

文献综述一孕妇外周血中胎儿红细胞的临床应用及其分离富集技术研究

攻读学位期间发表的论文