应力刺激下VEGF缓释剂促进组织工程骨血管生成与成骨的实验研究

摘要

背景和目的：目前应用组织工程骨(tissue engineering bone，TEB)修复大段骨缺损时，其成骨效能低、愈合时间长，甚至出现延迟愈合和不愈合，使修复归于失败，其主要原因是大块TEB植入体内早期营养摄取不足，种子细胞活力下降甚至凋亡，中、晚期新生的骨痂塑形、改建所需时间长。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)在血管再生中起着重要作用，但在体内的半衰期短，直接应用疗效差，须制备VEGF缓释剂以最大限度地提高其生物学作用。此外，研究表明周期性应力刺激能加快新生骨痂的塑形、改建，促进骨愈合，但是这种周期性应力刺激能否促进组织工程骨的愈合需要进一步研究。为此，本实验主要目的包括(1)制备出具有良好缓释特性的VEGF/藻酸盐微球，并将微球与ECs、MSCs共培养，观察其对离体ECs的增殖作用及对MSCs增殖与分化的影响；(2)通过对羊股骨解剖学参数测定，研制出微动型交锁髓内钉，建立了新型羊股骨段状骨缺损模型；(3)利用该模型研究应力刺激下VEGF/藻酸盐微球对TEB的血管生成与成骨作用的影响。 方法：(1)采用滴出法制备VEGF/藻酸盐微球，用双抗体夹心法测定其包封率、突释率及释放时间；(2)用MTT法、流式细胞仪、免疫组织化学、RT-PCR等技术观察其对离体ECs和MSCs的增殖及对MSCs成骨诱导分化的影响；(3)研制周期性应力刺激仪，并监测VEGF/藻酸盐微球在应力刺激下的释放特性；(4)在对羊股骨解剖学参数测定的基础上，研制微动交锁髓内钉固定系统，利用生物力学、X线摄片等技术在体内、外测量微动性能和力学强度；(5)用研制的微动交锁髓内钉创建新型羊股骨段状骨与骨膜缺损模型，通过大体观察、X线摄片、组织病理学和生物力学评估其科学性与可行性；(6)制备同种异体的羊DBM，应用扫描电镜、生物物理学和生物力学等方法检测了其理化特性和生物力学特征；(7)用同种异体羊DBM与自体MSCs构建TEB，通过基因转染荧光标记、激光共聚焦成像及扫描电镜技术观察了MSCs在DBM上生长、增殖及体内的成活情况；(8)利用放射性核素骨显像、墨汁灌注、组织病理学、免疫组织化学定性与定量评估在周期性应力刺激下，VEGF/藻酸盐微球对TEB血管生成的效果；(9)应用X线评分，双能X线分析、组织病理学和生物力学测试等方法进一步评估在周期性应力刺激下，VEGF/藻酸盐微球对TEB成骨愈合的的促进作用。 结果：(1)应用滴出法成功制备了VEGF/藻酸盐微球，载药量为(8.70±0.63)ng/mg，包封率为(87.0±3.3)％，释放时间为(16.1±1.3)d；(2)密度为0.2mg/ml、2mg/ml的VEGF/藻酸盐微球均使ECs的S和G2期增多，生长曲线前移，峰值增高；(3)根据所测羊的步频(81.5±4.0)次/分，负重压力(22.7±8.2)Kg等参数，研制了周期性应力刺激仪，其参数范围：压缩频率为60～150次/分，冲头位移距离0～3mm，压缩时间0～10h。(4)用刺激频率80次/分，压缩幅度为1.5mm，刺激总时间为6h作用于VEGF/藻酸盐微球，早期可一定程度上促进VEGF'的释放，7天后，这种促进作用逐渐减小并消失。(5)第3代羊MSCs CD44+CD29阳性表达为93.6％、CD45为1.58％、CD<,62>为1.0％，密度为0.2mg/ml、2mg/ml的VEGF/藻酸盐微球与MSCs具有良好的生物相容性，细胞周期和增殖分数无明显改变，混合培养的MSCs可形成钙结节，表达骨钙素、成骨诱导基因cbfa-1和Ⅰ型胶原，定量检测碱性磷酸酶(ALP)活性也未受影响；(6)羊股骨与人的股骨形态相近似，长度平均(13.30±0.56)cm，其前曲度平均(9.0±1.3)°，近、远端髓腔直径与中段髓腔直径差别不明显(P>0.05)；(7)研制的微动交锁髓内钉系统经体内、外的微动性能测试，证实其随着压力增大微动范围也随之增大，但最大微动范围<1.5mm，最大抗压强度均在5000N以上，超过羊体重的20倍；(8)创建的山羊股骨2cm骨与骨膜缺损的动物模型，经24周观察骨折端为纤维瘢痕组织充填，股骨力线正常，无明显的侧弯，扭转、成角现象，4枚锁钉均位于髓孔内，无折断和退钉；(9)制备的羊DBM孔隙度较高(63±2.1)％、孔径大(413.3±41.7)μm、最大吸水率(417.7±44.4)％、具有良好的形变与形变恢复能力；(10)体外构建的TEB的MSCs黏附率达(9l±8.2)％，经28d观察，EGFP标记的MSCs可在体内生长、增殖；(11)放射性核素骨显像显示术后4、8周实验组的T/NT比值分别为4.33±0.25、11.09±0.50，均高于各对照组(p<0.05)，墨汁灌注及组织病理学，Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色均显示，与对照组相比，实验组的TEB血管呈网状分布，排列规律，管径大小相对较一致；(12)术后12、16周x线评分实验组为4.95±0.413和5.36±0.51，BMD值分别为(1.37±0.08)g/cm<'2>和(1.68+0.18)g/cm<'2>，术后16周极限扭力到正常83％，均明显高于各对照组(p<0.05)。 结论：(1)制备的VEGF/藻酸盐微球具有良好的载药量、包封率和缓释性能，不同密度VEGF/藻酸盐微球可明显地促进离体ECs的增殖；(2)研制了周期性应力刺激仪，观察到周期性应力刺激可一定程度促进VEGF/藻酸盐微球的早期释放；(3)密度为0.2mg/ml、2mg/ml的vEGF/藻酸盐微球均与MSCs具有良好的生物相容性，对其增殖、分化无明显影响；(4)研制的微动交锁髓内钉固定系统，经体内、外测试，其微动性能良好，最大微动范围<1.5mm，用其创建的山羊股骨2cm骨与骨膜缺损的动物模型科学、可行；(5)制备羊DBM孔隙度高、孔径大、吸水能力强、具有良好的形变与形变恢复能力，是理想的TEB支架材料；MSCs在DBM上黏附率达(91±8.2)％，经28d观察，EGFP标记的MSCs可在体内生长、增殖；(6)应力刺激下VEGF/藻酸盐微球对TEB早期的血管生成具有明显的促进作用；(7)应力刺激下VEGF/藻酸盐微球对TEB中、晚期的成骨具有显著的促进作用。

目录

论文说明:英文缩写一览表

声明

摘要

前言

主要实验方法

第一部分VEGF/藻酸盐微球的制备及其对血管内皮细胞增殖的影响

实验一VEGF/藻酸盐微球的制备及其缓释性能检测

实验二VEGF/藻酸盐微球促进离体ECs增殖的研究

实验三VEGF/藻酸盐微球在应力刺激下的释放性能检测

讨论

小结

参考文献

第二部分MSCs的纯化培养及其与VEGF/藻酸盐微球相容性的研究

实验一羊MSCs的原代培养与鉴定

实验二VEGF/藻酸盐微球对MSCs增殖与分化的影响

讨论

小结

参考文献

第三部分微动型交锁髓内钉的研制及山羊骨缺损模型的建立

实验一羊股骨解剖学参数测定与微动型交锁髓内钉的研制

实验二新型山羊股骨骨缺损模型的建立及其科学性评估

讨论

小结

参考文献

第四部分应力刺激下VEGF/藻酸盐微球促进组织工程骨修复作用的研究

实验一羊DBM作为骨组织工程支架材料的性能评估

实验二组织工程骨构建与MSCs体内外示踪观察

实验三应力刺激下VEGF/藻酸盐微球促进组织工程骨血管生成的观察

实验四应力刺激下VEGF/藻酸盐微球增强组织工程骨成骨作用的研究

讨论

小结

参考文献

全文总结

致谢

照片

综述一应力刺激促进骨愈合的研究进展

综述二VEGF促进组织工程骨血管化的研究进展

博士期间发表论文与获奖情况