肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究

摘要

[背景和目的]： 生物治疗是继手术、放疗和化疗之后临床治疗恶性肿瘤的第四种治疗模式。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究，人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞(CytoticTLymphocyte，CTL)发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子，而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位(epitopes)，因此，寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的关键。树突状细胞(Dendriticcells,DC)作为体内最强大的抗原提呈细胞，是免疫应答过程的始动者和调节者。负载CTL表位的DC疫苗因其免疫原性好、副作用小、便于应用等优势而成为目前抗肿瘤治疗研究的一个热点。 肝素酶(Heparanase，Hpa)是近年来新发现的一个肿瘤转移相关基因，在正常组织中仅低表达于淋巴细胞和骨髓等免疫组织，但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在，而且表达的水平与肿瘤的转移、TMN分期等临床预后不良指标明显相关，肝素酶已成为中晚期肿瘤治疗的一个良好靶位。那么肝素酶能否作为一种肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗?我们过去的研究表明，肝素酶全长基因负载的DC体外可以诱导肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有杀伤作用，而对肝素酶阳性但MHC不相匹配的胃癌细胞不具有杀伤效应，提示肝素酶氨基酸全长序列中一定存在能诱导特异性CTL反应的抗原表位。 本研究的目的在于寻找存在于肝素酶全长序列中的能够有效激发机体抗肿瘤效应的CTL表位。鉴于HLA-A2.1是中国人群中最为常见的HLAⅠ类分子的型别，阳性率高达50％，因此鉴定肿瘤转移相关抗原Hpa的HLA-A2.1限制性CTL表位将会对中国人群中肝素酶表达阳性的恶性肿瘤提供免疫治疗的基础。 [方法]： 1、采用超基序和量化基序相结合的方法对肝素酶的HLA-A2.1限制性CTL表位进行预测，并用分子模拟技术模拟表位肽与MHC分子结合的空间构象，分析结合参数以进一步提高预测的准确性，然后从结果中选取得分较高的5条肝素酶表位肽进行合成、纯化、分子量鉴定，利用T2细胞的特点对合成的候选肽与HLA-A2.1分子的进行亲和力分析；采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，从而筛选出能够有效激活CTL反应的肝素酶抗原表位。 2、采用密度梯度离心法分离并得到人外周血单个核细胞，利用rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α诱导扩增人成熟树突状细胞，并从形态学、细胞表面CD分子进行鉴定；用上述筛选的候选肽负载DC诱导产生特异性CTL，采用标准51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞(Hpa+，HLA-A2.1+)、U-2OS骨肉瘤细胞(Hpa+，HLA-A2.1+)、SW480结肠癌细胞(Hpa+，HLA-A2.1+)、MCF-7乳腺癌细胞(Hpa-，HLA-A2.1+)、HepG2肝癌细胞(Hpa+，HLA-A2.1-)以及转染了肝素酶全长基因的MCF-7/Hpa乳腺癌细胞(Hpa+，HLA-A2.1+)和转染了HLA-A2.1基因的HepG2/HLA-A2.1肝癌细胞(Hpa+，HLA-A2.1+)的免疫杀伤效应；采用HLA-A2.1单克隆抗体封闭上述靶细胞的HLA-A2.1位点，或以CD8单克隆抗体封闭效应细胞的CD8位点，再用肝素酶表位特异性CTL杀伤KATO-Ⅲ胃癌细胞，以研究筛选的肝素酶表位是否受HLA-A2.1限制以及CTL效应细胞的来源；采用标准51Cr释放实验研究肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤活性，以确定其可能存在的毒副作用；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。 3、将上述筛选的肝素酶候选表位负载C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)1Enge/J小鼠骨髓来源的DC(mDC)后，免疫小鼠三次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，采用51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ、U2OS、SW480、MCF-7、MCF-7/Hpa、HepG2、HepG2/HLA-A2.1细胞以及自体淋巴细胞和mDC的杀伤效应；ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。 [结果]： 1、采用超基序和量化基序方法联合预测出5条得分最高肝素酶表位肽：Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)；T2细胞亲和力分析发现预测的5条多肽均能与T2细胞有效结合；采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，结果表明，Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞具有明显的杀伤效应，而Hpa(353-361)和Hpa(400-408)诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的杀伤效应与阴性肽相同，提示Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可能是肝素酶特异性抗原表位。 2、采用密度梯度离心法分离HLA-A2.1阳性健康志愿者外周血中的单个核细胞(PBMC)，用重组人细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-a联合诱导扩增，经形态学观察以及采用流式细胞术对细胞表面CD分子进行鉴定，成功制备了PBMC来源的成熟DC；采用标准51cr释放实验检测Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)表位负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对不同来源肿瘤细胞的免疫杀伤效应，结果表明，肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且HLA-A2.1阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2.1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2.1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶全长基因的MCF-7细胞(MCF-7/Hpa)和转染了HLA-A2.1全长基因的HepG2细胞(HepG2/HLA-A2.1)重新产生明显的免疫杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异、且受HLA-A2.1限制；采用标准51Cr释放实验验检测上述肝素酶抗原表位诱导的肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤效应，结果表明肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞无明显杀伤效应，提示肝素酶多肽疫苗的安全性(表1)；采用ELISPOT、技术检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力，结果表明，肝素酶抗原表位能促进效应细胞IFN-γ的分泌。 3、用上述肝素酶表位肽负载C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)1Enge/J小鼠骨髓来源的DC(mDC)，然后免疫小鼠三次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，以不同来源的多种肿瘤细胞作为靶细胞，用51Cr释放法检测杀伤效应，实验结果表明，肝素酶表位特异性的CTL对肝素酶阳性且HLA-2阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2.1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2.1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对感染了肝素酶全长基因的重组腺病毒(rAd-Hpa)的MCF-7乳腺癌细胞(MCF-7/rAd-Hpa)和转染HLA-A2.1的HepG2/HLA-A2.1细胞亦重新产生明显的杀伤效应，对自体淋巴细胞和mDC亦无明显杀伤效应(表1)。ELISPOT技术检测肝素酶抗原表位能有效促进肝素酶特异性效应细胞分泌IFN-γ。 [结论]： 1、采用超基序和量化基序法并通过体外杀伤实验从肝素酶的全长氨基酸序列中筛选出了3条HLA-A2.1限制的CTL表位，即Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL),以上肝素酶抗原表位与德国学者的报道不同。 2、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可以诱导产生肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且HLA-A2.1相匹配的肿瘤细胞具有很强的免疫杀伤活性，对肝素酶阴性或HLA-A2.1阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶或HLA-A2.1的肿瘤细胞具有杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受HLA-A2.1限制，肝素酶特异性CTL主要来源于CD8阳性T淋巴细胞。 3、从体外及动物实验二方面证实肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和/或DC无明显的免疫杀伤活性，提示肝素酶多肽疫苗临床应用的安全性。 4、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)负载的DC可以促进效应细胞：IFN-γ释放。 以上研究表明，人肝素酶特异性抗原表位[Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)]不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应，而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环，这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点，为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩写对照

声明

第一章肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测及初步鉴定

前言

第一节肝素酶来源HLA-A2.1 CTL表位的预测

实验材料与方法

结 果

第二节肝素酶来源HLA-A2.1 CTL表位的分子模拟

实验材料与方法

结 果

第三节肝素酶HLA-A2.1 CTL预测表位的合成及鉴定

实验材料与方法

结 果

第四节肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的亲和力分析

实验材料与方法

结 果

第五节肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的实验鉴定

实验材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二章肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗体外免疫效应研究

前 言

第一节外周血来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

实验材料与方法

结 果

第二节肝素酶CTL表位负载的DC疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究

实验材料与方法

结 果

讨论

参考文献

第三章肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL反应的研究

前 言

第一节 小鼠骨髓来源的DC分离、培养及鉴定

材料与方法

结 果

第二节肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL反应的研究

实验材料与方法

结 果

讨论

参考文献

全文结论

致 谢

照 片

文献综述CTL表位多肽疫苗抗肿瘤研究进展

硕士期间发表文章及专利申请情况