CD4CD25调节性T细胞在乙肝疫苗弱/无应答中的作用及机制研究

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是一种非细胞毒性DNA病毒，侵入机体后可引发特异性免疫反应，引起肝脏的急性或慢性病理损伤。据世界卫生组织统计，目前全球将近有3.5亿乙肝病毒携带者，每年约有＞25万人死于乙肝病毒感染的相关疾病，而且这种死亡率正逐年增加。因此，针对乙肝病毒有效的免疫疗法是全世界关注的热点问题。 我国是一个乙肝大国，有许多人正遭受着乙肝病毒的困扰，要做到有效地控制乙肝病毒感染，首先要做好预防工作。近20年来，对于预防乙肝病毒最有效和传统的路线就是注射保护性的乙肝表面抗原疫苗。但是，据调查统计在按照常规的0、1、6月程序对健康者进行全程免疫之后，仍会有5％～10％的接种者抗体始终阴性或达不到保护阈值(抗体滴度＜10IU/L)，表现为弱应答或无应答，重新成为乙肝病毒的易感者，这种现象称为疫苗免疫失败，但是目前对于这种机理尚不十分清楚。 许多学者经过多年研究，证实乙肝疫苗免疫失败与众多因素有关，如疫苗本身的抗原纯度、疫苗的剂量、疫苗的灭菌方法、疫苗是否严格按冷链要求贮运，疫苗的接种部位、接种途径、接种次数，以及接种者的年龄、性别、新生儿接种者的出生体重等有关。但是在消除了上述因素之后，乙肝疫苗免疫失败的现象仍无法避免。 后来，有人提出这种无应答现象是否是由于体内的APC细胞功能缺陷不能够有效地捕获、加工和递呈HBsAg或者是由于B7共刺激分子的表达缺陷而导致机体免疫功能下调以及HBsAg抗原特异性的T细胞克隆丢失等，但是这一系列假设在后来的实验中都逐一被否定了。 机体依靠复杂的免疫网络系统发挥免疫功能，既能通过正向调节对抗原刺激产生应答，又有一套负向调节机制来限定免疫应答的范围、作用程度及持续时间。这些负向调节机制主要通过胸腺T细胞阴性选择导致中枢耐受以及免疫无能、免疫忽视等导致的外周耐受。然而近年来，对于CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcell，简称Treg)的研究并发现这是一群具有免疫抑制功能的细胞，对维持机体内环境稳定和维持自身免疫耐受起重要作用，能够通过主动的方式抑制免疫系统对自身和外来抗原的应答，进而成为免疫学领域以及临床研究的热点。 目前，Treg在自身免疫性疾病、肿瘤和器官移植方面研究比较深入，已经证实它能够通过抑制其他CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖来抑制机体的免疫应答。有研究报道，在慢性乙肝患者体内检测到一群持续升高比例的Treg，并且这群HBV特异性Treg能够通过抑制CD8+T细胞的增殖而下调机体抗病毒免疫，从而导致慢性感染。并且，还有一系列报道证实了CD4+CD25+Treg细胞能够通过抑制Th细胞而抑制B细胞的活化和分化。其中，Seo等的研究表明CD4+CD25+Treg细胞通过抑制Th细胞从而抑制自身应答性抗-dsDNAB细胞的活化。在正常BALB/c小鼠体内存在着自身应答性抗-dsDNAB细胞，该细胞处于无能状态，当给该小鼠输入Th细胞后，抗-dsDNAB细胞得到辅助，B细胞开始活化、增殖，并分化成浆细胞产生抗体。然而，当同时输入Th细胞和CD4+CD25+Treg细胞后，抗-dsDNAB细胞虽然活化、增殖，却不能分化为浆细胞产生抗体。HyungW.Lim等研究发现在人的淋巴器官扁桃体中，Treg细胞可以在趋化因子的作用下，移行至扁桃体生发中心，通过抑制GC-Th细胞，而下调生发中心Th依赖的B细胞应答，包括B细胞的存活、B细胞活化后诱导的胞嘧啶脱氨酶的表达和免疫球蛋白产生。 基于以上的研究背景，我们提出假设，乙肝疫苗弱/无应答现象是否与此类细胞相关，在乙肝疫苗弱/无应答者体内Treg频率是否上调，并且这群Treg细胞是否具有HBsAg抗原特异性，是否能够通过抑制Th细胞而影响Th依赖的B细胞抗体应答，从而导致机体的这种抗体弱/无应答现象的发生。 由于近年来已逐渐证实CD4+CD25+双阳性的T细胞并非真正意义上的调节性T细胞，CD25是T细胞活化的标志之一，CD4+CD25+双阳性的T细胞中也包含了一部分活化的CD4+T细胞。对于定义Treg细胞，目前最为肯定的金标准就是FOXP3的表达，FOXP3是FOX(frokheadbox)转录因子家族的一名成员，特异地高表达于CD4+CD25+调节性T细胞上，介导调节性T细胞发育及功能的维持，可反映CD4+CD25+调节性T细胞的活性水平，因此把CD4+CD25+FOXP3+的T细胞定义为真正意义上的调节性T细胞。 因此，我们通过流式细胞仪技术检测乙肝疫苗弱/无应答者外周血中的CD4+CD25+T细胞的频率，通过RT-PCR实验检测了弱/无应答者外周血PBMC中FOXP3的mRNA表达情况，以判断Treg细胞与弱/无应答的相关性；用HBsAg再次在体外诱导弱/无应答者PBMC，用CFSE染色的方法检测PBMC的增殖程度，以证明Treg的抑制性，并通过流式检测其中的Treg频率是否上调，以霍乱毒素作为对照，以证明弱/无应答者体内Treg的抗原特异性；通过磁珠分选剔除弱/无应答者的外周Treg后，再用HBsAg诱导，看是否能够从CD4+CD25+的T细胞中重新诱导出一群新的抗原特异性的CD4+CD25+FOXP3+的Treg细胞；由于Th2细胞辅助B细胞活化主要靠分泌细胞因子IL-4即B细胞活化因子，诱导B细胞增殖活化并分泌抗体，并且在Th2的极化过程中IL-4也发挥关键作用，所以我们通过流式检测弱/无应答者外周血剔除与不剔除Treg用HBsAg诱导后IL-4的分泌状况，以判断Treg对Th2细胞的极化以及Th2细胞本身活化分泌细胞因子是否具有抑制作用，以致于影响了Th2依赖的B细胞抗体应答。 实验结果显示，与强应答者相比，在弱/无应答者的外周血中确实能够检测到一群比例较高的CD4+CD25+Treg细胞，并且其FOXP3的表达呈阳性，提示弱/无应答与Treg细胞之间存在高度相关性；淋巴细胞增殖实验显示经HBsAg诱导后弱/无应答者的外周血PBMC的增殖能力明显低于强应答者，并且以CT抗原作为对照，证实在弱/无应答者体内确实能够诱导出一群HBsAg抗原特异性的CD4+CD25+FOXP3+的Treg细胞，提示这群抗原特异性的Treg细胞可能通过下调机体的免疫应答而参与弱/无应答的发生机制；而且我们发现从弱/无应答者CD4+CD25+的T细胞中能够重新诱导出一群新的HBsAg抗原特异性的CD4+CD25+FOXP3+的Treg细胞，提示在弱/无应答者体内还存在这样一群细胞可能通过发挥其抑制作用而进一步下调了体内的免疫应答；在Treg的剔除实验中，发现弱/无应答者外周血经剔除Treg后其IL-4的分泌明显高于不剔除的分泌，而强应答者两组之间则无显著差别，因此提示，在弱/无应答者体内Treg细胞可能通过抑制IL-4的分泌而影响了Th2细胞的极化以及本身的活化，从而抑制了Th2依赖的B细胞抗体应答。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前言

第一部分乙肝疫苗弱/无应答与Treg的相关性分析

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分体外实验

第一节 Treg的抑制性及其抗原特异性实验

材料与方法

实验结果

讨论

第二节从CD4+CD25-的T细胞中诱导新的HBsAG抗原特异性CD4+CD25+FOXP3+Treg

材料与方法

实验结果

讨论

第三节Treg对Th2细胞极化及功能的影响

材料与方法

实验结果

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述：CD4+CD25+调节性T细胞研究进展

攻读硕士期间发表论文