基于葛根芩连汤主要难溶性有效成分的新型自微乳给药系统吸收机理研究

摘要

目的：本文是在已有研究基础上的继续与深入，已有研究采用天然乳化剂（natural emulsifier，NE）取代50％合成非离子型表面活性剂（nonionic surfactants，NS），成功构建了同时含有葛根芩连汤中三种主要难溶性成分葛根素（Pueratin，PUE）、黄芩苷（Baicalin，BA）、盐酸小檗碱（Berberine Hydrochloride，BH）的新型自微乳化给药系统（NE self-miroemulsifying drug delivery system，NE- SMEDDS）与NS-SMEDDS。本文从细胞（in vitro）、肠灌流（in situ）及动物（in vivo）多个水平研究PUE、BH、BA吸收机制及他们对吸收的相互影响；NE-SMEDDS与NS-SMEDDS对PUE、BH、BA吸收的促进作用及NE-SMEDDS是否降低NS-SMEDDS的毒性；磷脂复合物（phospholipid complex，PC）及PC-SMEDDS对BA吸收的促进作用。
　　方法：（1）构建Caco-2细胞模型，从细胞水平研究PUE、BH、BA及其SMEDDS的细胞吸收转运特性。通过比较表观通透系数(Papp)、累积转运量(ΔQ)、转运速率（v）和药物外排率（efflux rate，ER）等参数，①考察浓度、时间、P-gp抑制剂（维拉帕米）对PUE、BH、BA及他们的SMEDDS（NE-SMEDDS及NS-SMEDDS）转运机制的影响；②考察PUE+BH+BA及他们的SMEDDS体系中各成分的相互影响；③将BA制成BA-PC，研究不同药脂比（1:2.5、1:3.0、1:4）对BA吸收机制的影响，以及将BA-PC进一步制成SMEDDS对BA吸收的影响。
　　（2）构建大鼠在体肠灌流模型，从在体器官水平研究 PUE、BH、BA及其 SMEDDS的肠道吸收。①考察PUE、BH、BA单种成分、三种成分及单种成分与三种成分的SMEDDS不同肠段、浓度的小肠吸收，通过吸收速率常数（Ka）、表观渗透系数(Peff)等参数，比较PUE、BH、BA在肠道的主要吸收部位及吸收特性；②研究药脂比为1:2.5和1:4.0的BA-PC及BA-PC- SMEDDS对BA肠道吸收的影响。
　　（3）构建大鼠肠系膜淋巴模型，从动物水平研究PUE+BH+BA及他们的SMEDDS通过淋巴循环和血液循环的吸收相关性。采用SD大鼠口服给药，①收集不同时间段的淋巴液，以1h为一个时间段，共收集12h；②通过眼眶取血，收集不同时间点（0、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12h）的血液；○3样品经乙腈沉淀蛋白后流动相复溶，HPLC检测淋巴液和血液中各成分浓度，将淋巴转运结果与药动学数据进行比较，考察两种SMEDDS中三种成分通过淋巴与血液吸收的差异性及相关性。
　　（4）采用MTT法考察两种SMEDDS的细胞毒性，通过免疫荧光法和测定细胞跨膜电阻值（Trans epithelial electric resistance，TEER）研究两种SMEDDS对细胞完整性的影响。
　　结果：（1）Caco-2细胞模型研究。PUE、BH及 BA均属于小肠难吸收成分，而且主要为被动吸收机制。PUE、BH与BA均为P-gp底物，但外排转运以BH最强，BH的外排率分别是PUE、BA的4.85倍和8.78倍。成分之间存在吸收的相互影响：PUE对BH、BA均有显著的促吸收作用；BH与BA之间相互抑制，以BA的抑制作用更强；BH抑制PUE细胞转运的作用明显大于BA。PUE与BH单一成分的SMEDDS能促进PUE及BH的吸收，而且NS-SMEDDS转运速率高于NE-SMEDDS，同时不改变PUE与BH的吸收机制。PC可以增加BA脂溶性，提高BA生物膜转运量，然而随着药脂比增加，BA-PC的吸收呈下降趋势。但BA-PC制备成SMEDDS后有利于PC分散，对提高BA的生物膜转运产生协同作用，而且药脂比越高的SMEDDS越有利于促进BA的吸收，BA-PC-NS-SMEDDS中BA的吸收整体高于BA-PC-NE-SMEDDS。研究结果表明SMEDDS可以同步促进三种成分配伍后的吸收。
　　（2）大鼠在体肠灌流模型研究。在Caco-2细胞模型研究基础上，进一步说明PUE、BA的肠道吸收属于一级动力学过程，三者在肠道内的吸收均主要为被动扩散机制。PUE与BA单一成分的吸收部位主要在结肠，BH在小肠上段。将PUE、BH、BA单一成分分别制备成SMEDDS，在促进药物各个肠段吸收的同时不改变药物的主要吸收部位。随着药脂比增加，BA-PC的吸收同样呈下降趋势，然而药脂比越高的SMEDDS越有利于促进BA的吸收。三种成分配伍时，各成分吸收均有所降低，成分之间存在相互作用，结果类似于Caco-2细胞模型，而且PUE、BH、BA的主要吸收部位均在结肠。将三种成分制成两种不同的SMEDDS，可以同步促进PUE、BH、BA的肠道吸收，而且SMEDDS中PUE、BH、BA的主要吸收部位仍在结肠。
　　（3）大鼠肠系膜淋巴模型研究。不同给药组中，PUE、BH、BA在血液循环和淋巴循环中均有吸收，但血液吸收量多于淋巴。各成分吸收总量的大小依次为 PUE＞BA＞BH（P＜0.05），BH通过血液循环和淋巴循环吸收均很少，明显低于PUE与BA（P＜0.05）；淋巴转运比例大小依次为PUE＞BH＞BA，BA各给药组均从血液循环吸收为主。SMEDDS对 PUE、BH、BA淋巴转运具有显著性促进。SMEDDS促进 PUE吸收作用尤为突出，NS-SMEDDS与NE-SMEDDS对PUE的淋巴转运量具有显著性差异；药脂比为1:4.0的PC与SMEDDS联合促进了BA的淋巴吸收量，并且PC-NS-SMEDDS中BA淋巴转运相对较高。
　　（4）Caco-2细胞毒性与完整性研究。MTT实验、测定TEER值以及免疫荧光实验结果表明两种 SMEDDS都能通过破坏细胞膜的骨架和紧密结构蛋白来改变细胞膜的完整性与流动性，增加细胞膜的通透性，从而促进药物跨膜转运，且含有吐温-80越多的NS-SMEDDS对细胞膜的通透作用更大。
　　结论：研究结果表明，PUE、BH及BA均以被动吸收为主，同是P-糖蛋白的底物；PUE、BH及BA配伍对彼此吸收具有一定的影响；NS-SMEDDS与NE-SMEDDS可以打开细胞紧密连接，降低细胞单分子层完整性，从而可以同步增加PUE、BH及BA配伍后的吸收；NE-SMEDDS可以降低 NS-SMEDDS的毒性，但促进 PUE、BH及 BA吸收的效果整体没有NS-SMEDDS强；PC与SMEDDS联合对BA吸收的有促进作用。

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前言

第一章 主要难溶性成分及其SMEDDS的细胞转运研究

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 主要难溶性成分及其SMEDDS大鼠在体肠灌流研究

1材料

2 方法

3 结果

4.讨论

本章研究小结

参考文献

第三章 主要难溶性成分及其SMEDDS肠淋巴吸收研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

本章研究小结

参考文献

第四章SMEDDS对Caco-2细胞毒性及完整性研究

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

本章研究小结

参考文献

全文总结

攻读学位期间发表的论文

致谢