创面愈合中SDF-1的表达对表皮干细胞迁移作用的机制研究

摘要

皮肤作为人体最大的器官，外层的表皮终身不断自我更新。这种更新由表皮基底层具有再生能力的角质形成细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤角质形成细胞主要包括表皮干细胞(epidermalstemcell，ESC)、短暂扩增细胞(transitAmplifyingcell,TAcell)以及终末分化细胞(postmioticdiffetrentiatingcell，PMDcell)。其中，位于表皮基底层的表皮干细胞持续增殖分化以取代外层终术分化细胞，从而在维持组织结构的更新、细胞内环境的稳定，尤其在创伤后创面修复过程中起着至关重要的作用。付小兵等[2]，通过建立动物创伤模型，观察到创面愈合过程中，随着时间的推移创缘周围尤其是棘层或颗粒层出现多个散在的β-整合素(β1-intergin)及K19阳性表达的细胞，且越接近创面这些阳性细胞越密集；此种阳性细胞被认为是表皮干细胞。目前，关于这种表皮干细胞在创缘周围数量逐渐增多并且密集分布的具体机制并不十分清楚。 创伤愈合早期，创周组织大量渗液，这些渗液中富含细胞因子、细胞外基质及内毒素等成分。这些细胞因子在创伤愈合过程中具有重要作用，它们可以调节创伤修复过程中的多种细胞反应，影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放等。因此我们推测很可能是由创周组织分泌液中的某些细胞因子成分及其位于细胞表面或胞体内的受体共同介导了表皮干细胞的分布变化及数量改变，而这种改变很可能就是趋化因子及其受体介导的趋化效应。 为了对表皮干细胞的在创缘周围所表现出的分布及数量改变的机制进行初步探索，本实验首先通过建立大鼠创伤模型，运用免疫组织化学方法对创伤后不同时相点表皮干细胞的组织学分布进行定位；ELISA检测趋化因子SDF-1在创周组织中的表达情况，并观察创伤条件下表皮干细胞在创缘的分布变化趋势与SDF-1表达情况的相关性。其次，通过选择两种经典的细胞表面标志物-β1-intergin及角蛋白19(K19)，对体外培养获得的表皮干细胞进行鉴定；并运用免疫荧光化学方法和流式细胞仪技术对体外培养的表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况进行了检测。最后，利用Transwell培养体系，观察从烧伤患者创面预先收集的创面分泌液对表皮干细胞的体外趋化作用，并对其作用机理进行初步探讨。 具体研究方法及结果如下： 1、创伤后不同时相点大鼠表皮干细胞的组织学分布定位 采用免疫组织化学方法，结果显示伴随创面愈合进程，表皮干细胞的定位分布不象正常皮肤那样呈单层片状、散在分布于表皮基底层，而是由单层逐渐增加为双层乃至多层，特征性的改变是棘层或颗粒层出现多个散在的β1-intergin、K19和BrdU滞留剂标记阳性细胞，且越接近创面这些阳性细胞更加密集，其数量随着创面的缩小渐逐增加，至创面愈合、上皮化，这些阳性细胞仍然存在。组织形态学上表现为新生表皮组织较正常组织明显增厚。 2、创缘周围组织SDF-1的表达情况检测 酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测创缘周围组织匀浆上清中SDF-1的表达情况。以正常组织匀浆上清作为对照组。 创缘周围组织中SDF-1在伤后24h天开始逐渐表达，其表达量随着创面愈合进程呈上升趋势，于创伤后第7天达到各检测时相点的最高值；对照组中SDF-1呈微量表达，伴随创面愈合进程组间各组SDF-1变化未见显著差异。 3、人表皮干细胞的分离培养及鉴定 获取5～15岁行包皮环切术的年轻患者术后的包皮组织，利用中性蛋白酶和胰酶两步分离法以及表皮干细胞对IV型胶原的快速黏附对细胞进行筛选，筛选出的干细胞在IV型胶原上生长良好，细胞形态均一，呈“铺路石状”，细胞小而圆，核浆比例大，表现出原始细胞的形态特征，具有较高的克隆形成率、表皮干细胞表面标记物K19、β1-integrin呈阳性表达，说明通过该方法较为成功的培养出人表皮干细胞。 4、人表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4情况的检测免疫荧光化学检测体外培养表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况；结果显示：①细胞胞膜及胞浆内FITC荧光染色呈阳性；②流式细胞仪检测表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4的阳性百分率约为43.5％。 5、创面分泌液的收集及其对表皮干细胞体外趋化作用的实验研究 均取自本院烧伤研究所烧伤患者创面分泌液(n=6)，采用无菌操作，10ml注射器抽取创面分泌液或痂下积液，收集离心取上清，滤纸过滤后微型过滤器抽滤除菌，-70℃无菌保存备用。 利用Transwell培养体系进行体外趋化实验结果显示，创面收集液组从微孔膜上层迁移至下层的细胞数约为(87±9.12)，明显多于CXCR4受体拮抗组(21±2.71)和K-SFM对照组(15±3.28)(P＜0.05)。受体拮抗组稍多于K-SFM对照组，但无显著差异(P＞0.05)。 通过以上实验结果我们可以初步得出结论： 1、创伤条件下SD大鼠表皮干细胞分布发生改变，不仅位于于表皮基底层，且在创缘周围呈密集分布并伴有数量增多的趋势。 2、SD大鼠创缘周围组织中SDF-1大量表达，伴随创面愈合进程呈逐渐升高的趋势直至创面愈合；而创面对侧正常皮肤组织中SDF-1呈微量表达，在创面愈合过程中表达量未见明显变化。 3、表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4。 4、创面分泌液对表皮干细胞具有较为明显的体外趋化作用，该趋化效应在不排除其它信号通道共同作用的情况下，主要由SDF-1/CXCR4所介导。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分创缘组织中SDF-1的表达情况与表皮干细胞组织学分布的相关性研究

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分表皮干细胞的体外分离培养和鉴定及其表达趋化因子受体CXCR4情况检测

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分创面分泌液对表皮干细胞体外趋化作用的实验研究

引 言

材料与方法

结 果

讨论

小 结

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述表皮干细胞与创面愈合关系的研究进展

攻读硕士研究生期间发表及撰写的论文