缺氧对神经干细胞CXCR4表达的影响及调控机制探讨

摘要

缺氧是最常见在病理因素之一，在一些临床疾病和特殊军事劳动作业中常有发生。神经干细胞(NSCs)的研究为中枢神经系统缺氧损伤的治疗开辟了新的领域。在脑损伤后，NSCs能向相应的脑组织部位迁移、增殖并分化成为子代神经细胞参与组织的修复和功能的重建。阐明缺氧对NSCs生物学特性的影响及调控的分子机制，不但能为有效拮抗缺氧的病理损害提供理论依据，而且对于临床缺氧相关疾病的防治和保障特殊军事劳动作业环境中人员的健康，提高军队战斗力具有重要的意义。缺氧对NSC的影响分直接效应和通过引起微环境改变而产生间接效应两个方面。本课题拟在体外培养的NSCs模型上，通过研究缺氧对NSCs上CXCR4表达的直接影响，以及缺氧后小胶质细胞上清液对NSC的间接效应观察，来探讨NSCs功能是否受到缺氧应激环境的调控。同时，从缺氧刺激CNS内源性大麻素含量增加的现象入手，进一步观察内源性大麻素对NSCs分化的影响及STAT3相关分子机制，探讨NSCs的分化受到缺氧间接调节的可能途径。本课题为深入了解缺氧对NSCs生物学特性的影响及其分子机制提供实验依据，并为缺氧相关疾病的防治提供新的线索。 一、缺氧对NSCs上CXCR4表达的影响 目的：观察不同缺氧条件下，CXCR4在NSCs上的表达改变，进而探讨缺氧影响NSCs功能的分子机制。 观察指标与方法： 1.采用体外培养NSCs细胞，分为对照，缺氧(1％O2)4h，缺氧16h，以及缺氧4h+复氧(21％O2)8h、缺氧16h+复氧8h五组。通过RT-PCR，Westernblot检测各时相点NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表达的变化。 2.采用缺氧16h的培养N9小胶质细胞株的上清培养液，分别孵育NSCs4h、16h，通过RT-PCR，Western-blot检测各时相点NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表达的变化。 3.采用培养N9细胞进行对比研究，分别缺氧4h、16h，通过RT-PCR，Westemblot检测各时相点NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表达的变化。并通过transwell细胞迁移实验观察缺氧对细胞迁移能力的影响。 主要结果： 1.缺氧处理4h和16h，未能引起NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表达的明显改变。在缺氧4h+复氧8h、缺氧16h+复氧8h两组上，也没有观察到CXCR4mRNA及蛋白表达的明显改变。 2.缺氧16h后N9细胞的上清培养液孵育NSCs4h、16h，均未观察到NSCs上CXCR4mRNA及蛋白表达的明显改变。 3.缺氧4h、16h后，N9细胞上CXCR4mRNA及蛋白表达明显上调，并导致了细胞迁移能力的显著性增强。 结论：直接缺氧和小胶质细胞缺氧后的上清液处理都不能引起NSCs上CXCR4的表达改变，而相同的缺氧条件却能上调N9细胞上CXCR4的表达并增强细胞迁移能力。这提示对CXCR4的表达的调控可能不是缺氧影响NSCs功能的机制之一。 二、STAT3在内源性大麻素2-AG促NSCs胶质分化中的作用 目的：观察内源性大麻素2-AG对NSCs分化的影响及STAT3信号通路在其中的作用。 观察指标与方法： 1.采用RT-PCR，检测NSCs上CB1和CB2mRNA表达情况；采用细胞免疫荧光化学，观察CB1和CB2在NSCs上的蛋白表达。 2.采用1μM，10μM2-AG分别处理NSCs2d和6d，通过细胞免疫荧光化学，观察NSCs分化为神经元和星形胶质细胞比例的改变。 3.采用1μM，10μM2-AG分别处理NSCs15min、30min、60min，通过Western-blot，检测STAT3磷酸化水平的变化；利用STAT3抑制剂Stattic及CB1、CB2受体拮抗剂AM251、AM630预处理1h，通过Western-blot进一步观察2-AG对STAT3磷酸化水平的影响。 4.通过EMSA，检测10μM2-AG处理1h对NSCs上STAT3核转位与DNA结合的影响；通RT-PCR，检测1μM，10μM2-AG处理1h对STAT3下游基因GFAPmRNA表达的影响。 5.采用Western-blot，检测1μM，10μM2-AG处理30min对NSCs上JAK1-3和Src磷酸化水平的影响。 6.采用细胞免疫荧光化学，观察STAT3抑制剂Stattic对2-AG诱导的NSCs胶质分化的影响。 主要结果： 1.在体外培养NSCs上，能检测到CB1和CB2mRNA表达。而且，CB1和CB2蛋白均与Nestin蛋白有共表达。 2.两种剂量2-AG均能引起NSCs胶质分化的比例显著上升。 3.两种剂量2-AG均能引起STAT3磷酸化水平的显著上调，SFAT13抑制剂及CB1受体拮抗剂能阻断这一效应，而CB2受体拮抗剂却无显著影响。 4.2-AG能引起STAT3DNA结合增强，并且能导致其下游基因GFAPmRNA表达上调。而这一效应能被STAT3抑制剂及CB1受体拮抗剂阻断。 5.两种剂量2-AG均不能引起JAK1-3磷酸化水平的显著改变，却能显著上调Src磷酸化水平；CB1能阻断2-AG引起的Src磷酸化。 6.STAT3抑制剂不完全地抑制了2-AG诱导的NSCs胶质分化。 结论： 1.内源性大麻素促进了NSCs胶质分化，这可能是缺氧通过调节内源性大麻素来影响NSCs分化的间接途径之一。 2.Src/STAT3信号通路参与了CB1依赖的内源性大麻素促NSCs胶质分化，这为阐明缺氧通过内源性大麻素间接影响NSCs分化的分子机制提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 大鼠胚胎神经干细胞分离、培养与鉴定

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 缺氧对神经干细胞CXCR4表达的影响

前 言

实验一 缺氧模型的构建

材料与方法

结 果

实验二 缺氧对神经干细胞CXCR4表达的直接影响

材料与方法

结 果

实验三 小胶质细胞缺氧后的上清液对神经干细胞CXCR4表达的影响

材料与方法

结 果

实验四 缺氧影响小胶质细胞CXCR4表达的对比研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 STAT3在大麻素影响神经干细胞分化中的作用

前 言

实验一 CB1和CB2在NSCs上的表达

材料与方法

结 果

实验二 内源性大麻素2-AG对NSCs分化的影响

材料与方法

结 果

实验三 内源性大麻素2-AG激活STAT3信号分子

材料与方法

结 果

实验四 2-AG处理对JAKs磷酸化及Src磷酸化的影响

材料与方法

结 果

实验五 抑制STAT3磷酸化对2-AG诱导的NSCs胶质分化的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述神经干细胞迁移分化的分子机制研究进展

博士在读期间发表的论文