CT-1/TTC融合蛋白的表达、纯化与靶向神经元逆向运输及神经营养活性鉴定

摘要

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种给个人、家庭及社会带来巨大医疗、心理和经济负担的突发性事件。大量的研究证明，成年哺乳动物只有外周神经可以再生，中枢神经系统(central nervous system，CNS)不能再生。与外周神经和胚胎CNS相比，损伤轴突不能再生的主要原因是：残存成熟神经元内在的再生能力下降；CNS微环境中存在轴突生长抑制因子；胶质细胞增生形成的瘢痕阻碍轴突生长。近年来研究证明，当提供适当的条件后CNS能够再生，而且这些轴突的再生是由中枢神经元固有特性(intrinsic properties)和所处的微环境决定的。然而许多措施虽然可以促进轴突出芽，但由于胶质细胞形成的胶质瘢痕和抑制因子阻碍了神经的生长，再生轴突中的大部分围绕细胞或组织移植区生长，很少有神经纤维跨越损伤区而进入远端，要建立功能性轴突联系更加困难。如果能够应用药物进行干预，将是一种简单易行的方法。 心肌营养素(cardiotrophin-1，CT-1)是1995年由Pennica等发现的一种细胞因子，属IL-6超家族。它具有比睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)更强的促神经元存活作用。由于CT-1受体糖蛋白130(glycoprotein130，gp130)与低亲和力亚基白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor receptorβ，LIFR-β)均属于细胞因子同源性受体，CT-1与gp130、LIFR-β结合后激活相关酪氨酸激酶，导致信号传导与转录活化因子磷酸化，对非神经元细胞有广泛作用，使其临床应用受限。 破伤风毒素(Tetanus toxin，TeNT)是破伤风杆菌产生的，抑制脊髓运动神经元递质释放的神经毒素。它可特异地与神经元末梢结合并内在化，逆行运输至神经元，并可跨神经元间迁移。TeNT蛋白由一个重链和一个轻链组成，重链介导与神经末梢结合，轻链产生神经毒性。重链的C端片段(Tetanus toxin C Fragment，TTC)由451个氨基酸组成，能与神经特异结合并逆行运输，而没有神经毒性。因而，TTC可作为靶向神经元并逆行运输的非毒性分子，目前已有相关报道。 我们设想，如果将CT-1基因与TTC基因融合，表达CT-1/TTC融合蛋白，使其同时具有与神经元特异性结合和促进神经元存活、克服CT-1对其它细胞的非特异性作用。同时，这种融合蛋白不但可在脊髓损伤局部用药，也可在脊髓特异传导束的肌肉支配区和蛛网膜下腔反复用药，通过神经特异结合并逆行运输至相应的神经元，可为脊髓损伤后的修复提供一种新的特异因子、新的给药方式。 本研究主要目的在前期构建表达质粒，在DHsa表达融合蛋白，并在体外PC12细胞验证活性的基础上，拟进一步提高表达效能，在体验证基因融合表达CT-1/TTC融合蛋白的TTC片段靶向性转运大分子至脊髓神经元及被转运的CT-1片段神经营养活性。 技术路线及试验方法： 第一部分：pGEX-CT-1/TTC原核表达质粒载体在BL21(DE3)大肠杆菌菌株中高效表达，并纯化； 1.利用冻存的大肠杆菌DHsa pGEX-CT-1/TTC菌株抽提pGEX-CT-1/TTC质粒，酶切、双酶切验证。转化至蛋白酶突变大肠杆菌BL21(DE3)菌株。挑单克隆菌落在37℃下震摇过夜，抽提质粒，酶切再次鉴定，两次酶切结果提示在预期条带大小出现目的条带，表达菌株构建成功。 2.利用将BL21(DE3) pGEX-CT-1/TTC经过IPTG诱导在不同诱导时间、不同温度优化表达，超声裂菌，离心，对各组上清和沉淀行SDS-PAGE蛋白电泳，分别用考马斯亮蓝和WB方法验证目的蛋白表达结果。 第二部分：分析CT-1/TTC融合蛋白靶向性转运活性： 制备SD大鼠坐骨神经损伤模型(离断性)，将实验动物单纯随机分为正常对照组、损伤对照组、坐骨神经再生室给药组、肌肉注射给药组，自由放养一周，灌注固定取脊髓腰膨大，冰冻切片，免疫组化检测。观察靶向性转运CT1/TTC融合蛋白阳性脊髓前角运动神经元细胞。 第三部分：分析CT-1/TTC融合蛋白神经营养活性； 制备6～7天新生SD大鼠坐骨神经损伤动物模型，将动物分为正常对照组、损伤对照组、给药组。自由放养一周，灌注固定取脊髓腰膨大，冰冻切片。尼氏染色，计数脊髓前角运动神经元并成对t检验统计分析。 主要结果及结论： 1.将pGEX-CT-1/TTC转化入表达载体BL21(DE3)菌株； 2.优化得到目的蛋白的表达条件，于35℃Sh诱导表达效能高； 3.纯化获得2.7mg/ml的CT-1/TTC融合蛋白，总量共计约15mg； 4.坐骨神经再生室给药组、肌肉注射组SD成年大鼠在脊髓腰膨大前角运动神经元检测到目的蛋白； 5.于6～7天SD大鼠坐骨神经损伤后，t检验统计给药组与正常对照组、损伤对照组存在显著性差异。

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文摘

英文文摘

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前 言

第一部分pGEX-CT-1/TTC原核表达质粒载体在BL21(DE3)大肠杆菌菌株中表达，并纯化

材料与方法

小结

参考文献

第二部分CT-1/TTC融合蛋白靶向性转运活性作用

材料与方法

小结

参考文献

第三部分CT-1/TTC融合蛋白神经营养活性作用

材料与方法

小结

全文结论

致谢

图片

参考文献

文献综述：破伤风毒素C端片段转导结构域研究进展

攻读硕士期间发表的学术论文