激活TRPV1改善血管功能和预防高血压的机制研究

摘要

背景和目的：高血压是临床常见病和多发病，其主要并发症有中风、心肌梗死及肾功能衰竭，严重危害人们的身心健康。原发性高血压发生机制目前尚不十分清楚，目前认为高血压病的病因为多因素，可分为遗传因素和环境因素两个方面，是遗传因素和环境因素相互作用的结果。原发性高血压发病率呈上升趋势，其防治具有重要意义。流行病学研究表明，多种饮食因素可影响血压，在过去的十余年中，通过减少钠盐的摄入、增加钾盐的摄入和增加以蔬菜和水果为基础的“清淡饮食”的摄入，可有效的降低血压。红辣椒的主要成分一辣椒素，常常作为一种食品添加剂，是短暂受体电位通道-香草醛亚型1(TRPV1)的高选择性激动剂。TRPV1主要分布在神经系统中，激活TRPV1可引起细胞内钙升高。研究发现，急性激活TRPV1可引起血管舒张，血压一过性下降：也有研究表明，急性激活TRPV1后，血管收缩，血压升高。而长期激活TRPV1后，对血管和血压的影响未见报道。我们既往还发现，辣椒素可激活脂肪细胞TRPV1导致细胞内钙增加，减少脂质在细胞内的堆积，辣椒素长期干预可预防高脂饮食诱导的肥胖。据报道，TRPV1在血管内皮细胞也有表达。我们推测，长期激活TRPV1可能有助于改善血管功能和预防高血压。eNOS和PKA是一氧化氮(NO)的合成和释放的关键信号转导蛋白，都受钙信号的调控。因此我们推测，激活TRPV1可能通过细胞内钙变化上调上述信号转导蛋白的表达，促进内皮细胞NO的合成和释放，从而改善血管功能和预防高血压。 为了验证上述假设，本研究分为三部分进行。第一部分通过RT-PCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光染色验证TRPV1在小鼠血管内皮细胞和小鼠及自发性高血压大鼠(SHR)肠系膜动脉中表达和分布情况。第二部分分题一通过应用辣椒素急性激活TRPV1后，观察其对小鼠肠系膜动脉舒张功能的影响。分题二通过长期辣椒素饮食干预C57/BL6J野生型小鼠和TRPV1基因敲除型小鼠，观察TRPV1激活后对血压正常者血管功能和血压的影响；分题三通过长期辣椒素饮食干预SHR大鼠，观察TRPV1激活后对高血压者的血管功能和血压的影响。分题四通过长期辣椒素干预，观察其对SHR内源性大麻素系统的影响。第三部分通过检测辣椒素刺激后血管内皮细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)变化，明确内皮细胞上的TRPV1通道的功能变化。通过检测不同干预组内皮细胞及各组动物肠系膜动脉组织NO合成相关信号蛋白的表达，检测辣椒素刺激后血管和内皮细胞NO合成和释放的变化情况，明确TRPV1激活后对血管功能和血压作用的机制。 材料与方法：整个研究由离体实验和在体实验两部分组成。离体实验以培养的小鼠胸主动脉内皮细胞以及肠系膜动脉为研究对象。在体试验采用了多种动物模型。首先以C57/BL6J野生型和TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠及SHR为模型，分为辣椒素组(含辣椒素饲料喂养)和对照组(普通饲料喂养)。另外还以TRPV1过表达的转基因(TRPV1-tg)小鼠、TRPV1杂合子小鼠(TRPV1+/-)及其同窝野生型小鼠为动物模型，均以普通饲料喂养。 1.分别用RT-PCR、蛋白免疫印迹检测TRPV1蛋白和mRNA在血管内皮细胞和肠系膜动脉中的表达；用免疫荧光染色法观察TRPV1在血管内皮细胞和肠系膜动脉中的分布。 2.应用小血管张力测定技术检测辣椒素急性刺激后或长期干预后小鼠和SHR肠系膜动脉舒缩功能的变化。 3.采用鼠尾测压方法测定小鼠及SHR鼠尾血压变化情况；颈动脉插管测定小鼠平均动脉压及急性静脉推注乙酰胆碱和硝酸甘油后的血压变化情况；应用无线遥测信号系统检测辣椒素干预后大鼠血压变化情况。 4.比率荧光成像系统检测辣椒素刺激后血管内皮细胞[Ca2+]i的变化，观察TRPV1特异性拮抗剂辣椒卓平或TRPV1基因敲除后对钙信号变化的影响。 5.蛋白免疫印迹法检测血管内皮细胞和肠系膜动脉组织NO合成相关信号蛋白(PKA、phospho-PKA、eNOS、phospho-eNOS)的表达。 6.荧光显像技术检测辣椒素刺激对内皮细胞NO合成和释放的影响，及应用TRPV1受体拮抗剂、eNOS抑制剂和IPKA抑制剂对内皮细胞NO生成的影响：比率荧光成像系统检测辣椒素刺激后小鼠肠系膜动脉NO的合成、释放情况，应用TRPV1受体拮抗剂、eNOS抑制剂对肠系膜动脉NO生成的影响及辣椒素刺激后不同基因型小鼠肠系膜动脉NO的生成情况。 结果： 1.TRPV1在血管内皮细胞和小鼠及SHR大鼠肠系膜动脉中均有表达。 2.急性激活TRPV1后，呈浓度依赖性方式舒张苯肾上腺素预收缩的小鼠肠系膜动脉，TRPV1基因敲除后、去除内皮、应用eNOS抑制剂或PKA抑制剂明显减弱血管的舒张反应。长期激活TRPV1后可显著改善阻力血管-肠系膜动脉的内皮依赖性舒张功能，降低小鼠胸主动脉对血管紧张素II诱导的收缩。 3.长期激活TRPV1或TRPV1过表达后，可增强小鼠对乙酰胆碱诱导的降压反应。长期激活TRPV1后，可降低SHR的血压。 4.辣椒素呈浓度依赖性诱导血管内皮细胞[Ca2+]i的升高，TRPV1基因敲除或辣椒卓平预处理可抑制[Ca2+]i的升高。 5.辣椒素刺激可显著上调野生型小鼠血管内皮细胞phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表达，PKA抑制剂可降低phospho-eNOS蛋白的表达；辣椒素刺激对TRPV1-/-小鼠血管内皮细胞phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表达无明显影响。长期激活TRPV1后，野生型小鼠和SHR肠系膜动脉phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表达增强，在TRPV1-/-小鼠中变化不明显。 6.辣椒素刺激可增加血管内皮细胞NO的合成、释放，应用TRPV1受体拮抗剂、eNOS抑制剂和PKA抑制剂可降低内皮细胞NO的生成。辣椒素呈浓度依赖性方式增加小鼠肠系膜动脉NO的生成，应用TRPV1受体拮抗剂、eNOS抑制剂可减弱NO的合成、释放；辣椒素刺激后，TRPV1 tg小鼠肠系膜动脉NO生成最强，WT次之，TRPV1-/-最弱。 结论： 1.TRPV1在小鼠血管内皮细胞和小鼠及SHR肠系膜动脉中均有表达。 2.急性或长期激活TRPV1后，能改善阻力血管的内皮依赖性舒张功能，降低SHR血压。 3.激活TRPV1可引起[Ca2+]i的升高，上调phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表达，促进血管内皮细胞和肠系膜动脉NO的生成。提示长期激活TRPV1后，通过cAMP/PKA-eNOS信号通路促进NO的合成、释放，是其改善血管功能、预防高血压的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 TRPV1在内皮细胞和肠系膜动脉中的表达和分布

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分 激活TRPV1改善血管功能和预防高血压的作用

分题一急性激活TRPV1对血管舒张功能的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

分题二长期激活TRPV1对小鼠血压和血管功能的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

分题三长期激活TRPV1对SHR 血压和血管功能的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

分题四 激活TRPV1对SHR内源性大麻素系统的影响

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三部分 激活TRPV1改善血管功能和预防高血压的机制

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

全文结论

致 谢

附图

文献综述 TRPV1通道与心血管疾病研究进展

攻读博士学位期间发表论文

英文论著:Activation of TRPV1 by Dietary Capsaicin Improves Endothelium-Dependent Vasorelaxation and Prevents Hypertension