微波辅助—多相溶剂萃取—多元多维指纹图谱技术在决明子质量控制中的应用

摘要

决明子（Semen cassiae）是豆科决明属植物决明（Cassia obtusifolia L.）或小决明（Cassia tora L.）的干燥成熟种子，具有益肾明目、润肠通便、清肝祛湿等功能，是国家卫生部首批公布的药食同源中药材之一，在我国常用于治疗羞明多泪，头痛眩晕、视物昏暗等症状。决明子中主要含有蒽醌类、黄酮类、萘骈吡喃酮类、多糖类、脂肪酸和氨基酸类等成分，对于其有效成分的提取多用回流提取法、冷浸法等方法进行，此类提取方法不仅提取时间长、提取效率低、消耗的有机溶剂多，对环境的影响较大。微波辅助萃取法是利用微波与介质的热效应和非热效应对中药材中的目标成分进行提取，萃取时间短、效率高、溶剂用量少、对环境友好。本文采用微波辅助萃取法以(NH4)2SO4/丙酮/正庚烷三相溶剂萃取体系为萃取溶剂，研究了多相体系的形成及微波辅助萃取决明子有效成分的萃取条件；以色谱和光谱分析方法检测，获得各相化学成分的指纹图谱；基于各相萃取成分的性质差异和指纹图谱数据，构建决明子药材多元多维指纹图谱数据库；为更全面的反映药材的特征信息，准确、有效地控制决明子药材质量，建立决明子药材的质量控制评价方法，主要内容如下：
　　1、利用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）及不同的色谱分析检测手段对决明子药材进行分析，分别建立了决明子中不同极性成分的分析方法。以乙腈—0.1％磷酸作为流动相进行梯度洗脱、在278 nm处紫外检测，用HPLC法测定了决明子中的蒽醌、黄酮及萘骈吡喃酮类等成分；以270 nm为激发波长、440 nm为发射波长，HPLC-荧光检测，测定了具有荧光特性的成分；以KBr压片法对决明子多糖进行了IR光谱分析，并通过多糖水解和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化，以乙腈—磷酸盐缓冲溶液（50 mmol/L，18:82）作为流动相，于245 nm处检测，用HPLC-PMP衍生化法测定了决明子多糖的单糖成分；利用毛细管柱—GC法对非极性成分进行了分析。结果表明：分析方法适用性好，各色谱峰分离度良好，精密度、重复性和稳定性的RSD值小于2%，满足分析要求。
　　2、以双水相为基础构建了三相溶剂萃取体系，针对决明子有效成分的性质，通过筛选确定了以(NH4)2SO4/丙酮/正庚烷体系为萃取溶剂，分别采用改进单纯形优化法和星点设计—效应面法对三相溶剂体系的组成和微波辅助萃取条件进行了优化。结果表明：利用该溶剂体系不同相的萃取性能差异，可分别将低极性组分，蒽醌、黄酮和萘骈吡喃酮类等成分，以及多糖类成分分别萃取到上相（正庚烷）、中相（丙酮）和下相（硫酸铵水溶液）中。当以正庚烷、丙酮和硫酸铵质量百分数分别为7.1%、31.9%和9.2%组成为萃取溶剂时，微波辅助萃取时间16.5 min、萃取温度83.0℃、液料比56:1时决明子有效成分的提取效率最高。
　　3、依据上述萃取条件，采用所建立的色谱、光谱分析检测方法对12批次不同产地的决明子药材进行了萃取分离和测定，分别建立了正庚烷相的GC指纹图谱、丙酮相的HPLC-UV和HPLC-RF指纹图谱，以及水相决明子多糖类成分的HPLC-PMP和FT-IR指纹图谱，并采用主成分分析和聚类分析方法研究了决明子药材的分类特征。结果表明：12批次决明子样品的指纹图谱相似度均高于0.9，符合中药指纹图谱相似度评价的研究要求；基于成分信息最多、可靠性最强的HPLC-UV指纹图谱的聚类分析结果可将其分为五类：第一类S2（广西）；第二类 S5（广东）；第三类 S6（广东）；第四类S7（广东）、S10、S11（上海）；第五类S1、S3（广西）、S4（湖北）、S8（安徽）、S9、S12（上海）。
　　4、利用三相萃取决明子有效成分的特征，基于上述GC指纹图谱、HPLC-UV指纹图谱、HPLC-RF指纹图谱、HPLC-PMP指纹图谱和FT-IR指纹图谱五种标准指纹图谱，构建了决明子药材的多元多维指纹图谱数据库。为了全面反映决明子药材的特征信息，依据各分析方法的特点，建立了决明子药材的质量评价方法，并对三种不同的市售决明子药材的质量进行评价和甄别，结果表明：其中两种决明子药材的HPLC-PMP、HPLC-RF、HPLC-UV指纹图谱的相似度低于0.9，故鉴别为假冒伪劣药材；而另一种药材的各项评判指标均高于所建立的标准，评为合格的决明子药材。说明所建立的决明子药材的质量评价模式准确度较高、可靠性强，可以全面用于决明子药材的质量控制。
　　5、利用紫外分光光度法分别测定了12批次决明子多糖对羟基自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，以考察决明子多糖的体外抗氧化活性。结果表明：12批次决明子药材所获得的多糖均具有一定的抗氧化活性，在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内，其抗氧化活性随着浓度的升高逐渐增强，但12批药材表现出明显的活性差异，按其活性大小大致可分为3类：第一类S1、S2（广西）、S12（上海）；第二类S7（广东）、S9、S10、S11（上海）；第三类S3（广西）、S4（湖北）、S5、S6（广东）、S8（安徽），综合分析发现，来自于广东地区决明子多糖样品的抗氧化能力要比上海地区和广西地区的高。

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第一章 文献综述

1.1 决明子概述

1.2 决明子的研究进展

1.3 微波辅助萃取技术的研究

1.4 三相溶剂萃取技术的发展概况

1.5 中药指纹图谱技术的研究进展

1.6 本课题的主要研究内容与意义

参考文献

第二章 HPLC-UV法和HPLC-RF法分析决明子中有效成分

2.1 前言

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

参考文献

第三章 微波辅助—三相溶剂体系萃取分离决明子中的有效成分

3.1 前言

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

参考文献

第四章 决明子三相溶剂萃取体系—丙酮相成分HPLC指纹图谱的研究

4.1 前言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

参考文献

第五章 决明子气相色谱指纹图谱的研究

5.1 前言

5.2 仪器与试剂

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

参考文献

第六章 决明子多糖类成分的指纹图谱研究

6.1 前言

6.2 仪器与试剂

6.3 实验方法

6.4 结果与讨论

6.5 本章小结

参考文献

第七章 基于决明子多元多维指纹图谱数据库的质量控制研究

7.1 前言

7.2 仪器与试剂

7.3 实验方法

7.4 结果与讨论

7.5 本章小结

参考文献

第八章 决明子多糖的抗氧化活性研究

8.1 前言

8.2 仪器与试剂

8.3 实验方法

8.4 结果与讨论

8.5 本章小结

参考文献

附录 攻读学位期间发表的论文

致谢