蛋白酶激活受体-2在海水吸入大鼠急性肺损伤中的作用及机制研究

摘要

背景与目的： 海水淹溺可引起海水吸入型急性肺损伤(SW-ALI)，进一步发展可导致海水型急性呼吸窘迫综合征(SW-ARDS)，病情凶险，死亡率高。由于炎症反应是ALI发病的关键环节，人们将对ALI的研究转向炎症调控机制的研究，以期控制炎症反应，减轻损伤，从而降低ALI的发病率和死亡率。蛋白酶激活受体-2(PAR2)属G蛋白偶联受体家族，激活后可参与炎症反应，但在肺部炎症反应中的致病作用还存在争议，在SW-AIL中的作用尚未提及，且PAR2激活后下游信号通路仍不清楚，有待进一步探讨。FUT-175作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制PAR2的激活，减少炎症介质和细胞因子的释放，但其抗炎作用在ALI的研究中尚未提及，有待进一步研究。为此，本课题拟从细胞水平检测海水对A549细胞PAR2表达的影响，从分子水平探讨PAR2激活后的下游信号转导通路以及FUT-175和PAR2抗体对其下游信号通路的干预作用，从器官水平观察FUT-175对SW-ALI大鼠肺部炎症反应和肺微血管通透性的影响，旨在明确PAR2在SW-ALI中的作用及机制，从抗炎的角度揭示FUT-175对SW-ALI大鼠的保护作用，为临床应用FUT-175治疗SW-ALI提供更坚实的理论基础和实验依据。 方法： 1.将培养的A549细胞接种于6孔板中，随机分为对照组(control)、海水干预2、4、8、16h组，各组细胞干预相应的时间后进行指标观测。收集上清检测TNF-α和IL-8浓度，收集细胞用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测PAR2 mRNA和蛋白表达水平。 2.将培养的A549细胞接种于6孔板中，随机分为对照组(control组)、海水干预组(seawater组)、海水+PAR2抗体组(PAR2-antibody组)、海水+FUT-175组(FUT-175组)、海水+SB203580组(SB203580组)、海水+PD98059组(PD98059组)、海水+SP600125组(SP600125组)。对照组加入无血清培养液，海水组加入海水培养8h；PAR2-antibody组用PAR2单克隆抗体2mg/L预处理1h后，加入海水继续培养8h；FUT-175组用FUT-17510μM预处理1h后，加入海水继续培养8h；SB203580组用SB20358010μM预处理1h后，加入海水继续培养8h；PD98059组用PD9805910μM预处理1h后，加入海水继续培养8h；SP600125组用SP6001250μM预处理1h后，加入海水继续培养8h。control组、seawater组、PAR2-antibody组和FUT-175组收集细胞用Western印迹法和EMSA法分别检测磷酸化p38MAPK蛋白表达量、磷酸化ERK蛋白表达量、磷酸化JNK蛋白表达量和NF-κB活化水平；各组细胞收集上清检测TNF-α和IL-8浓度。 3.采用海水吸入法复制大鼠ALI模型，吸入海水(4ml/kg)后成功建立ALl模型。将48只Wistar大鼠随机分为对照组、海水吸入2、4、8h组，取肺组织用实时荧光定量PCR法检测PAR2 mRNA表达水平，用Western blot法和免疫组化法检测PAR2蛋白表达情况。 4.采用海水吸入法和LPS吸入法复制大鼠ALI模型，96只Wistar大鼠随机分为对照组(control)、海水组(seawater组)、LPS组(LPS组)和FUT-175治疗海水吸入组(FUT-175组)。海水组和LPS组分别吸入海水(4ml/kg)和LPS(4mg/kg)建立ALl模型。seawater组：模型复制成功后20min，经尾静脉注射生理盐水2ml/kg。FUT-175组：海水型ALI模型复制成功后20min，经尾静脉注射FUT-17510mg/kg。4组大鼠观察8小时，分别于模型建立及干预后0.5、1、2、4、8h进行动脉血气分析，最后检测肺微血管通透性(PMVP)、肺湿/干重比(W/D)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)、血浆IL-8和TNF-α水平，并观察病理学变化。 结果： 1.与正常对照组比较，海水处理后，A549细胞PAR2 mRNA在4h时显著升高(P<0.05)，随着时间延长，在8h点达最高峰(为对照组的1.8倍)，此后一直显著高于对照组(P<0.01)。A549细胞PAR2蛋白表达量也在4h时显著升高(P<0.05)，在8h点达最高峰(为对照组的2.2倍)，此后一直显著高于对照组(P<0.01)。A549细胞经海水处理后，上清液中的IL-8和TNF-α迅速升高，2 h达最高峰，显著高于对照组(P<0.01)。此后有所下降，但在所有时间点均显著高于对照组(P<0.01)。 2.与正常对照组比较，海水处理后，A549细胞p38MAPK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和JNK磷酸化水平显著升高(分别为对照组的3.1倍、1.8倍和3.2倍)(P<0.01-0.05)，NF-κB活化水平显著升高(为对照组的6.7倍)(P<0.01)，而FUT-175和PAR2抗体预处理组同海水处理组比较，A549细胞p38MAPK磷酸化水平、JNK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和NF-κB活化水平显著降低(P<0.01-0.05)。海水处理后，A549细胞培养上清液中IL-8和TNF-α显著升高(P<0.01)，而FUT-175、PAR2抗体、SB203580、PD98059和SP600125预处理组同海水处理组比较，上清液中IL-8和TNF-α则显著降低(P<0.01)。 3.与正常对照组比较，海水吸入后，大鼠肺组织PAR2 mRNA和蛋白表达量在2h时即显著升高(P<0.05)，随着时间延长，在4h点达最高峰(为对照组的2.8倍)，此后均显著高于对照组(P<0.01)。同时大鼠肺组织PAR2蛋白表达量在2h时即显著升高(P<0.05)，随着时间延长，在4h点达最高峰(为对照组的4.2倍)，此后均显著高于对照组(P<0.01)。PAR2免疫组化显示，在正常对照组，PAR2微弱表达于肺泡、支气管上皮和肺泡巨噬细胞，海水吸入2h后，阳性反应明显增强，不仅见于肺泡和支气管上皮细胞，还见于肺微血管内皮细胞和气道平滑肌细胞。 4.与正常对照组比较，海水和LPS吸入致伤组大鼠PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增高、肺组织MPO活性增高、血浆IL-8和TNF-α升高、肺组织病理形态学积分增加(P<0.01)；海水组PaO2明显低于LPS组，而MPO、W/D和PVMP明显高于LPS组(P<0.01)。FUT-175治疗海水吸入组上述指标均显著改善(P<0.01-0.05)。 结论： 1.海水处理A549细胞，可上调A549细胞PAR2的表达，导致IL-8和TNF-α释放的增加，同时可导致A549细胞结构的改变。 2.海水激活A549细胞PAR2后，通过MAPK信号通路和NF-B信号通路，导致IL-8和TNF-α释放增加，是海水处理A549细胞导致细胞损伤的可能机制。 3.丝氨酸蛋白酶抑制剂FUT-175和PAR2抗体可通过抑制PAR2的激活，对海水处理的A549具有保护作用。 4.海水吸入后大鼠肺组织PAR2表达上调，在海水所致急性肺损伤中起重要作用。 5.丝氨酸蛋白酶抑制剂FUT-175对海水吸入所致急性肺损伤大鼠具有保护作用，其机制可能是通过抑制肺组织PAR2的激活，阻断其下游的炎症反应，减轻肺损伤，降低肺血管通透性，减轻肺水肿。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

前 言

第一部分海水对A549细胞表达蛋白酶激活受体-2影响的研究

材料与方法

结 果

讨论

第二部分 海水对A549细胞蛋白酶激活受体-2信号转导通路影响的研究

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分 蛋白酶抑制剂FUT-175对海水吸入急性肺损伤大鼠保护作用的研究

分题一 海水对大鼠肺组织表达蛋白酶激活受体-2影响的研究

材料与方法

结 果

分题二FUT-175对海水吸入急性肺损伤大鼠肺微血管通透性和炎症因子影响的研究

材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述 蛋白酶激活受体-2在肺部炎症反应中的研究进展

攻读博士学位期间发表的论文

英文论著