ZNRD1在食管癌及EC109细胞中的表达及其临床意义研究

摘要

背景: 食管癌是目前对人类健康和生命构成严重威胁的恶性肿瘤之一，在各种恶性肿瘤导致的死亡中食管癌占第六位，在我国一些高发地区居于各种恶性肿瘤的首位。食管癌预后较差，主要原因是肿瘤在早期即可发生外侵或转移。食管癌的发生发展是多基因共同作用的后果。目前在食管癌组织中已发现多种表达异常的基因和蛋白，但具有临床应用价值的分子标志物却甚少，能够对食管癌患者治疗效果和预后判断提供可靠依据的标志物尚需进一步研究证实和寻找。锌带蛋白基因l(Zinc ribbon domain-containing1，ZNRD1)是一种与转录相关的锌带蛋白，可能通过调节转录起始位点的选择、RNA合成的延长和终止在转录中发挥重要调控作用。ZNRD1的表达可以抑制胃癌细胞系在体内外的生长和致瘤性，并且能够抑制胃癌细胞系体外转化表型，进而逆转一些胃癌细胞系在体内外的恶性生长潜能，表明ZNRD1在肿瘤发展中能发挥一定的抑制作用，有可能是潜在的肿瘤基因治疗靶点。ZNRD1在食管癌细胞内的作用、其抗凋亡的机制、与食管癌发生有无关系等均未见报道。本研究一方面旨在探讨ZNRD1在食管癌组织中的差异表达，了解ZNRD1表达水平与患者临床病理特征和预后之间的关系；另外，以ZNRD1真核正义表达载体转染人源性食管鳞癌细胞系EC109，构建ZNRD1基因高表达的食管鳞癌细胞亚系，探讨ZNRD1过表达对EC109细胞增殖、凋亡、转移以及DNA损伤修复等生物学行为的影响和作用机制，为深入理解ZNRD1在食管癌中的作用奠定理论基础。研究结果可望为食管癌的基因治疗和预后判断提供具有一定临床应用价值的选择。 目的: 研究ZNRD1基因在食管癌组织及其对应近癌、远癌组织中的表达情况，了解ZNRD1表达水平与患者临床病理特征和预后之间的关系，为ZNRDI作为食管癌预后判断候选基因提供实验依据；检测食管鳞癌细胞系EC109中ZNRD1表达水平，构建ZNRDI表达上调的食管鳞癌细胞亚系，研究ZNRD1表达对食管鳞癌细胞系EC109增殖、凋亡以及转移等生物学行为的影响和作用机制；探讨ZNRD1表达水平对EC109细胞化疗药物敏感性及DNA损伤修复功能的影响及其可能的分子机制。 方法: (1)应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学(IHC)技术检测食管癌患者肿瘤组织及其对应近癌、远癌组织中ZNRD1基因的表达； (2)采用IHC技术检测食管癌患者肿瘤组织中ZNRD1蛋白的表达，结合随访资料进行统计分析； (3)应用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学(ICC)技术检测ZNRDI基因在食管鳞癌细胞系EC109中的表达； (4)利用脂质体转染法建立ZNRD1基因过表达的食管鳞癌细胞模型，并利用RT-PCR和Western blot技术进行鉴定； (5)利用MTT实验绘制转染细胞、对照细胞及亲本细胞的生长曲线； (6)通过Transwell侵袭小室实验检测ZNRD1过表达对食管鳞癌细胞侵袭活性的影响； (7)通过流式细胞仪分析转染细胞及对照细胞的细胞周期和细胞凋亡的变化； (8)通过MTT实验进行体外药物敏感性分析，计算细胞对药物的IC50值； (9)通过流式细胞仪和DNA断裂实验检测ZNRD1过表达对EC109细胞凋亡敏感性的影响； (10)利用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术检测紫外线(UV)照射对转染细胞及其对照细胞的DNA损伤修复效应； (11)通过基因芯片检测ZNRD1过表达对EC109细胞基因表达谱的影响； (12)利用RT-PCR和Western blot对基因芯片的结果进行鉴定。 结果: (1) ZNRD1在食管癌组织中的表达水平明显低于近癌及远癌组织；ZNRD1在食管癌患者肿瘤组织及其对应近癌、远癌组织中的表达率分别为29.5％、52.3％和72.7％，ZNRD1在近癌及远癌组织中的表达率显著高于肿瘤组织(P<0.05)； (2)转染细胞经RT-PCR和Western blot证实，成功建立了ZNRD1过表达的食管鳞癌细胞模型； (4) MTT实验及集落形成实验结果表明，上调ZNRD1可以导致食管鳞癌细胞系EC109生长及增殖速度减慢； (5) Transwell侵袭小室实验结果显示，上调ZNRD1可以显著降低食管鳞癌细胞系EC109的侵袭活性； (6)流式细胞仪检测结果表明，上调ZNRD1可以导致EC109细胞出现G1期阻滞，S期比例减少； (7)体外药物敏感实验结果表明，上调ZNRD1能够显著降低EC109细胞对5一氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、长春新碱(VCR)和阿霉素(ADR)的敏感性，增强EC109细胞对化疗药物的耐受性； (8)流式细胞仪检测及DNA断裂实验结果表明，上调ZNRD1可以降低EC109细胞对阿霉素的敏感性，增加食管鳞癌细胞株EC109的抗凋亡能力： (9) SCGE实验结果表明，上调ZNRD1表达水平能够显著增强EC109细胞的DNA修复能力，抑制紫外线照射对食管鳞癌细胞EC109的DNA损伤效应； (10)基因芯片检测结果表明，上调ZNRD1可能改变61种基因的表达水平； (11)经RT-PCR和Western blot证实，转染ZNRD1可以显著上调ERCC1、P-gp、Bc1-2、和MDR1等基因的表达。 结论: ZNRD1在食管癌组织中的表达水平显著低于对应近癌及远癌组织；ZNRD1表达水平与患者预后呈正相关：肿瘤组织中ZNRD1表达水平高者其预后明显优于ZNRDI低表达患者。食管鳞癌细胞系EC109中ZNRDl mRNA及蛋白表达均为阴性，上调ZNRD1可以在一定程度上逆转食管鳞癌细胞系EC109的恶性表型，导致EC109细胞生长和增殖速度明显减慢，细胞出现G1期阻滞，抑制EC109细胞的侵袭活性，ZNRD1可能通过调节CDKNIA等基因表达参与细胞周期调控。上调ZNRD1可以降低EC109细胞的药物敏感性，抑制EC109细胞凋亡。ZNRD1可能通过调节DNA损伤修复相关基因ERCC1及Bcl-2的表达水平进而参与紫外线及铂类化疗药物等DNA损伤因子对EC109细胞的DNA损伤效应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写索引

声明

前言

第一部分ZNRD1在食管癌组织中表达差异的研究

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

第二部分ZNRD1基因表达水平与食管癌患者预后之间关系的研究

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

第三部分ZNRD1对人源性食管鳞癌细胞系EC109生物学行为影响的研究

分题一ZNRD1高表达食管鳞癌细胞系的建立及鉴定

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

分题二 转染ZNRD1对EC109细胞生长、凋亡水平及侵袭活性的影响

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

分题三转染ZNRD1对EC109细胞化疗药物敏感性的影响

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

分题四 转染ZNRD1对EC109细胞DNA损伤与修复的影响

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

分题五转染ZNRD1对EC109细胞基因表达谱的影响

实验材料

实验方法

结 果

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述一ZNRD1基因研究进展

文献综述二锌离子代谢与食管癌之间的关系

攻读博士学位期间申请基金和发表论文情况

英文论著 Upregulation of ZNRD1 Enhances Cisplatin Resistance in Human Esophageal Cancer Cell by Regulation of ERCC1 and Bcl-2