酵母表达肽抗生素hPAB-β及其抗金黄色葡萄球菌L型的活性分析

摘要

肽抗生素(peptide antibiotics)是近年来发现的由生物体基因编码,具有抗生素样活性的小分子肽类物质,是宿主天然免疫的重要组成部分,与干扰素、补体等共同组成宿主的免疫防御系统。肽抗生素具有如下的生物学特点:多为一些小分子肽,由13-60个氨基酸组成,分子量在5kDa以下;具有两亲性结构;绝大多数带正电荷,富含精氨酸和赖氨酸残基,其所带有的强阳电荷是选择性作用于细菌胞膜的基础;具有广谱抗菌性,对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、真菌、病毒、寄生虫、癌细胞等都具有很好的活性。除了直接的抗菌功能外,肽抗生素还具有调节细胞增殖、诱导免疫、中和内毒素、促进伤口愈合和细胞因子释放等功能。此外肽抗生素独特的物理性“打孔”作用机制使细菌不易产生耐药性。传统抗生素的大量使用引起耐药菌株不断产生,因此寻找新的抗生素具有重要的现实意义。自1962年Kiss和Michl从铃蟾(Bombinavariegata)皮肤分泌物中分离得到铃蟾肽抗生素(bombinin)以来,在短短的几十年中已从植物、昆虫、节肢动物、两栖动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出近千种肽抗生素,或称为抗微生物肽(Antimicrobial peptide)。在临床耐药菌感染日益严峻的今天,肽抗生素的研究和开发利用无疑为人类抗感染治疗点燃了新的希望。
　　 肽抗生素hPAB-β为本实验室构建的一种截短型人hBD-2突变体,保持了与天然hBD-2相似的生物学活性。在前期工作中,我们利用酵母表达系统的高产量和可分泌型表达的优点,成功构建并筛选了能分泌表达hPAB-β的酵母工程菌pPIC9K-hPAB-β/GS115,通过酵母高密度发酵表达的hPAB-β经纯化后具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。根据肽抗生素独特的杀菌机制,我们推测肽抗生素对那些胞质膜裸露的病原体(如带包膜的病毒、细菌L型等)有更好的杀灭活性。细菌L型是细菌细胞壁部分或完全缺失后形成的原生质体,其生长条件和药物敏感性都与原菌有较大不同,在临床上不易诊断,常漏诊误诊。许多细菌都可形成L-型,其感染与临床的许多慢性疾病有关,诊断和治疗相对困难,故寻找细菌L-型敏感的新型治疗剂成为近年来研究的热点。我们利用重组毕赤酵母进行高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β,并根据肽抗生素的特性进行了纯化;利用低剂量抗生素(新青Ⅱ)诱导金黄色葡萄球菌L-型,并对L型进行了鉴定;探讨了肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型的活性;建立了金黄色葡萄球菌L型感染大鼠间质性肺炎的动物模型,为后续检测肽抗生素hPAB-β的体内抗L型感染研究奠定了基础。主要实验方法和结果如下:
　　 1.毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β
　　 利用毕赤酵母易于高密度发酵的特性,在3.7L发酵罐中对重组了肽抗生素hPAB-β表达盒的pPIC9K-hPAB-β/GS115酵母优5工程菌进行高密度发酵,在种子接种后的18-24h后添加补料生长培养基,保持细菌生长,待菌体湿重生长至200～250g/L后停止流加补料3h,然后向罐中流加诱导培养基,用甲醇诱导目标基因的表达,在甲醇诱导期间,菌体生长缓慢,持续诱导60h后下罐。用Brandford法测得3次发酵液的总蛋白浓度分别为664.0mg/L,781.8mg/L和721.3mg/L。用Bio-Rad公司Quantity One软件条带检测灰度分析工具对凝胶电泳后的蛋白条带进行分析,目的蛋白约占发酵上清液总蛋白的33.4％,故可知发酵上清中目的蛋白的表达量约为241.2+29.5mg/L,实现了重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β的目标。
　　 2.肽抗生素hPAB-β的纯化与鉴定
　　 纯化的目的不仅仅是要获得高纯度的目标产物,还要使目标产物的生物学活性在纯化过程中不丧失,这就要根据目标分子与杂质的差异设计纯化路线,经过试验摸索加以优化。考虑到hPAB-β为一阳离子小肽(pI9.001),我们设计了10kDa膜过滤、反相层析、阳离子交换、分子筛脱盐等纯化技术对目标肽进行纯化,最终从每升发酵液中纯化得到74.9±1.5mg目标蛋白,纯度达到98％以上,总体回收效率为31.5％,实现了酵母表达肽抗生素hPAB-β的分离纯化。利用Bio-Rad公司DC Protein Assay KitⅠ试剂盒进行蛋白定量,最终测得目标产物浓度为30.55mg/ml(约7.1mmol/L),进一步利用琼脂扩散法检测了纯化产物对革兰阴、阳性细菌的杀灭活性,结果表明纯化产物具有生物学活性,为进一步开展hPAB-β的生物学功能研究奠定了基础。
　　 3.金黄色葡萄球菌L型的诱导与鉴定
　　 利用新青Ⅱ纸片扩散法进行金黄色葡萄球菌L型的诱导,在高渗培养基的新青Ⅱ纸片抑菌圈内有呈针尖样大小的颗粒状菌落,低倍镜下观察呈典型的“油煎蛋”样,革兰染色可见这些颗粒状菌落中的细菌为革兰阴性的大球形、短杆形、丝状等多形态,挑取单菌落接种于高渗液体培养基中培养后细菌呈沉淀生长。滤过实验证实诱导的L型细菌能通过0.45μm的滤器,在撤去新青Ⅱ诱导剂后再培养数代,经血浆凝固酶和甘露醇发酵实验证实已完全回复为野生型金葡菌,透射电镜观察可见L型细菌细胞壁部分或完全缺失,菌体内结构疏松,少数呈巨型体,其胞壁全部脱落,最外层为脂质双分子层。上述实验表明经新青Ⅱ诱导获得的能在高渗培养基中生长的细菌确为金葡菌L型,为后续探索肽抗生素hPAB-β抗细菌L型活性创造了前提。
　　 4.肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型的活性分析
　　 利用重组毕赤酵母工程菌pPIC9K-hPAB-β/GS115进行高密度发酵,纯化,制备肽抗生素hPAB-β后。采用稀释法检测了重组hPAB-β对金黄色葡萄球菌L型的活性,在测定肽抗生素hPAB-β对金葡菌L型的抗菌活性时,我们选用了万古霉素,氯霉素,新青Ⅱ作对照。结果发现,在相同摩尔浓度(500μmol/L～4μmol/L)条件下,4种抗生素对金葡菌野生型的抗菌活性由强到弱分别为:新青Ⅱ＞肽抗生素hPAB-β＞万古霉素＞氯霉素;而对金葡菌L型而言氯霉素＞肽抗生素hPAB-β＞万古霉素＞新青Ⅱ。可见金葡菌ATCC25923转变成L型后,其对抗生素的敏感性发生了明显改变,表现在对作用于细胞壁的抗生素--新青Ⅱ的敏感性下降,而对氯霉素的敏感性增加。肽抗生素hPAB-β抗野生型的最小抑菌浓度(MIC)为8μmol/L(约34μg/ml),而对L型细菌的最小抑菌浓度(MIC)为32μmol/L(约137μg/ml)。实验结果显示肽抗生素hPAB-β抗L型细菌的抗菌活性较野生型相比差4倍,其原因可能是细菌L型的高渗培养基(含40g/L NaCl)对肽抗生素的活性有一定影响。
　　 5.金黄色葡萄球菌L型感染大鼠间质性肺炎动物模型的建立
　　 实验中设置无菌与野生菌对照组,采用腹腔注射方法感染大鼠,细菌注射后常规饲养15天后颈动脉放血处死后解剖大鼠,通过大体观察可见感染组大鼠肺体积增大,色暗红,淤血,肺表面可见明显出血性病灶,血管充血扩张。组织块细菌培养能分离到L型细菌。炎症细胞计数可见感染组白细胞明显升高,金黄色葡萄球菌野生型感染组中性粒细胞升高而L型细菌组中性粒细胞变化不大,这可能与L型缺失细胞壁有一定关系。病理切片观察L型细菌感染大鼠后表现为间质性肺炎病变,弥漫性肺泡间质增生,肺泡腔变窄,间质内伴淋巴细胞和单核细胞浸润,局部地方肺泡腔有红细胞渗出,血管充血扩张,小支气管上皮增生,腔内红细胞渗出。表明成功建立L性细菌感染大鼠间质性肺炎动物模型,为后续检测肽抗生素hPAB-β的体内抗菌活性奠定了基础。
　　 综上所述,本研究利用重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β,经10kDa膜过滤、反相层析、离子交换、分子筛层析等处理,从酵母发酵上清中纯化得高纯度目标产物74.9±1.5mg/L,总体回收效率为31.5％,目的蛋白浓度为30.55mg/ml(约7.1mmol/L),该纯化产物具有杀灭革兰阴、阳性细菌的能力。采用新青Ⅱ纸片法成功诱导金黄色葡萄球菌L型,通过形态学观察、滤过实验、回复实验、电镜观察鉴定为细菌L型。并用稀释法检测到肽抗生素hPAB-β对金葡菌L型有抗菌活性,其最小抑菌浓度(MIC)为32μmol/L(约137μg/ml)。成功建立了金黄色葡萄球菌L型感染大鼠间质性肺炎的动物模型,为后续深入探讨肽抗生素hPAB-β治疗L型细菌感染提供了实验依据,也为开展肽抗生素体内抗菌活性的检测奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一章 肽抗生素hPAB-β的酵母表达与纯化

第一节 毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β

材料与方法

结果

第二节 肽抗生素hPAB-β的纯化与鉴定

材料与方法

结果

第三节 讨论

第二章 肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型的活性分析

第一节 金黄色葡萄球菌L型的诱导与鉴定

材料与方法

结果

第二节 肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型的活性分析

材料与方法

结果

第三节 讨论

第三章 金黄色葡萄球菌L型感染S-D大鼠肺炎模型的建立

材料与方法

结果

讨论

全文小结

致谢

参考文献

文献综述 肽抗生素研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章