日本脑炎病毒核酸疫苗的构建及免疫原性研究

摘要

日本脑炎病毒(Japaneses encephalitis virus,JEV)又称乙型脑炎病毒,属黄病毒家族,经蚊虫叮咬传播,引起人类流行性乙型脑炎(简称乙脑)。目前乙脑主要流行于东南亚各国和远东地区,每年约45000人发病,其中10000人死亡。JEV感染后往往引发严重的中枢神经系统症状,死亡率较高,幸存者亦有半数以上发展为永久的神经系统后遗症。乙脑尚无有效的治疗手段,因此免疫接种是控制其流行、保护易感人群的重要措施,目前使用的JEV疫苗主要是几种灭活疫苗和SA14-14-2减毒活疫苗。虽然疫苗的使用显著降低了乙脑的发病率,但上述疫苗均有一定局限性:灭活疫苗存在高生产成本、免疫力不持久、需多次注射及存在变态反应等缺陷;而减毒活疫苗则存在毒力回复的危险。特别是2006年我国山西运城出现乙脑流行,报告成人乙脑病例66例,其中死亡19例;并且2005-2007年期间印度亦持续发生乙脑的大规模流行,因此亟待发展一种安全、有效、质优价廉的新型JEV疫苗,而核酸DNA疫苗是一个极具潜力的发展方向。
　　 黄病毒基因组为单股正链RNA病毒,约为11 kb,仅有一个开放阅读框(openreading frame,ORF),从5'到3'端依次编码3个结构蛋白(C、prM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在这些蛋白中,以E蛋白可诱生中和抗体(neutralization antibody)而最为重要;prM蛋白在病毒成熟过程中会被酶切为M蛋白,某些情况下,这一酶切并不完全,从而使prM蛋白成为潜在的中和抗体位点,并且E蛋白的正确折叠亦离不开prM蛋白;NS1蛋白则是借助抗体依赖性补体介导的途径发挥保护作用。当前的研究已经证实将表达prM-E/E或NS1的质粒免疫小鼠后,能够诱导特异性的保护免疫;并且小鼠被动免疫针对prM、E或NS1蛋白的单克隆抗体后亦能保护小鼠免受致死量病毒的攻击。因此,为进一步提高JEV核酸疫苗的免疫效果,构建核酸疫苗时同时表达prM-E-NS1蛋白,综合三者的保护性表位,不失为一个理想的选择。
　　 但是单纯的DNA疫苗尚不足以引发良好的免疫效果,需要借助佐剂,特别是近年来广泛使用的细胞因子佐剂,即在基因水平将细胞因子与核酸疫苗共同表达,利用细胞因子上调机体免疫水平的作用,进而增强核酸疫苗的效果。特别是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)因其具有可促进巨噬细胞及树突细胞(dendritic cell,DC)的浸润、成熟和活化,进而提高免疫系统的抗原提呈能力,增加疫苗的免疫原性等优点而得到了广泛关注,目前GM-CSF已被证实是良好的基因佐剂。
　　 目前来源于脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)序列已经广泛应用于异源基因的共表达,因此本研究采用同样的策略,构建了双顺反子表达载体pCAG-JEGM,在同一载体内共表达JEV prM-E-NS1片段和GM-CSF基因,两者由IRES相连。同时亦构建了单独表达prM-E-NS1的质粒pCAG-JE和单独表达GM-CSF的质粒pCAG-GM,以评价GM-CSF不同的免疫方式引起免疫反应的异同。实验流程、结果及结论如下:
　　 1.质粒构建
　　 JEV Beijing-1株感染C6/36细胞,提取病毒RNA;同时提取小鼠脾脏总RNA,分别以病毒RNA和脾脏RNA为模板,RT-PCR扩增,得到JEV prM-E-NS1片段和GM-CSF片段后,将该两片段分别插入pIRES质粒的多克隆位点A(multiple cloningsites A,MCSA)和多克隆位点B(multiple cloning sites B,MCSB),阳性克隆命名为pIRES-JEGM。进而经XhoⅠ和NotⅠ双酶切该质粒得到prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段后,将其克隆入具有鸡β-actin启动子的pCAGGSP7质粒的相应位点,阳性克隆经酶切和测序验证,命名为pCAG-JEGM。为进一步评价pCAG-JEGM的保护性效果,本研究继续构建了pCAG-JE(仅表达JEV prM-E-NS1)和pCAG-GM(仅表达GM-CSF)质粒。为了避免不同质粒之间引起机体反应性不同及表达效率的差异,该两个质粒的构建同样使用了pCAGGSP7质粒。上述质粒经测序和转染实验验证构建正确,可用于下一步的动物实验。
　　 2.动物免疫
　　 大量抽提各种质粒后,免疫6-8周龄BALB/c小鼠,分为5组,分别免疫pCAG-JEGM、pCAG-JE、pCAG-JE+pCAG-GM、pCAG-JE+pCAGGSP7和pCAGGSP7,其中免疫pCAGGSP7作为对照组,免疫剂量为100μg/次/只,间隔3周,共免疫3次。末次免疫后3周,部分小鼠处死,用于检测免疫学指标;部分小鼠则以50 LD50病毒量腹腔攻毒,进行保护性实验。
　　 3.抗体检测
　　 BALB/c小鼠于免疫前一天断尾取血,并在每次加强免疫前取血,分离血清后-80℃冻存;大量增殖病毒并浓缩病毒抗原用以包被96孔板,进行ELISA测定。首先监测免疫期间,小鼠在不同的时相点针对病毒抗原的免疫应答产生情况,所有的血清均以1:100稀释,测定492nm处OD值,结果显示:pCAGGSP7免疫组血清在观察期间一直处于低水平,加强免疫后,其抗体水平未发生任何变化,与预期相符;而pCAG-JEGM、pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7三个免疫组在第一次免疫后3周,即可检测到明显的抗体反应,并且免疫反应随着第二、三次加强免疫而进一步升高;然而矛盾的是,pCAG-JE+pCAG-GM共同免疫组则未有明显的抗体产生,即便经两次加强免疫,其抗体水平亦无明显变化,与其他三个免疫组相比,差别显著(P＜0.00001)。
　　 同时末次免疫后,处死小鼠,分离血清,同样以ELISA的方法测定各组anti-JEVIgG抗体滴度,结果显示:pCAG-JEGM免疫组抗体滴度最高1:2900,而pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7免疫组抗体滴度大致相当,分别为1:1300和1:1600;然而pCAG-JE+pCAG-GM免疫组仅显示了极低的抗体滴度(1:130),说明该组病毒抗原的表达受到了明显的抑制。进而继续用ELISA的方法检测了免疫血清的IgG抗体亚型,各组免疫血清显示了相近的IgG1和IgG2a水平。攻毒后各组抗体效价明显升高:pCAG-JEGM组为1:25600,pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7为1:12800,pCAG-JE+pCAG-GM组亦达到了1:6400;并且攻毒后血清IgG亚型以IgG1升高为主,提示攻毒后免疫反应以Th2型为主。
　　 4.中和试验
　　 一般认为E蛋白抗体特别是其中和抗体,在JEV感染过程中,发挥主要的保护作用,因此本研究检测了小鼠攻毒前后中和抗体的产生情况。结果显示:攻毒前各组仅显示了极低的中和抗体效价,pCAG-JEGM和pCAG-JE组中和抗体效价为1:20;pCAG-JE+pCAG-GM和pCAG-JE+pCAGGSP7组中和抗体效价为1:10;pCAGGSP7空质粒对照组中和抗体效价＜1:10;各组均未产生明显的的中和抗体,说明针对候选核酸疫苗并未产生无菌免疫(sterile immunity)。而攻毒后,各组中和抗体效价显著升高,pCAG-JEGM组为1:390,pCAG-JE组和pCAG-JE+pCAGGSP7相近,分别为1:260和1:290;pCAG-JE+pCAG-GM为1:130,提示记忆性B细胞的激活引起抗体滴度迅速升高。
　　 5.NS1抗体依赖性补体介导的细胞毒作用
　　 本研究除检测E蛋白诱导的中和抗体水平外,亦检测了NS1抗体介导的溶细胞作用。以JEV感染的L929细胞作为靶细胞,各组小鼠免疫血清经56℃灭活补体,在体外与豚鼠补体按照不同的稀释度和比例混合,37℃孵育1h后,接种至靶细胞中,孵育4h后,检测上清中的LDH释放。同时本研究还以pCAG-ME质粒(仅表达JEV prM-E蛋白)的免疫血清做平行对照。结果显示,pCAG-JEGM、pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7组显示了≥50％的溶细胞活性,而pCAG-JE+pCAG-GM的溶细胞活性明显低于上述三组,仅32％,与对照组相近,pCAG-ME和对照血清组仅显示了非特异性的溶细胞活性(分别为30％和23％)。
　　 6.淋巴细胞增殖实验和CTL检测
　　 7.小鼠保护性实验
　　 8.过继性转移(被动免疫)
　　 综上所述,GM-CSF的不同免疫方式引起的免疫反应不同:GM-CSF与病毒抗原同时表达时,能促进JEV的抗体的产生;而将两者分别构建在不同的质粒上,混合后免疫小鼠时,则会抑制免疫反应进而降低针对JEV的保护率。本研究的实验结果说明GM-CSF与目的抗原时空表达的差异会影响免疫应答的产生,GM-CSF具有一定的佐剂作用,但是使用时仍需谨慎。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

前言

第一章 日本脑炎病毒核酸疫苗的构建及鉴定

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章 日本脑炎病毒核酸疫苗的免疫原性研究

材料与方法

结果

讨论

小结

第三章 动物保护试验

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

致谢

附录

参考文献

文献综述 日本脑炎病毒重组疫苗研究进展

攻读博士学位期间发表的论文