几种TLR全基因标签单核苷酸多态性的筛选及其临床意义

摘要

研究背景:
　　 在天然免疫反应中,模式识别受体是最早识别病原微生物的关键分子。在模式识别受体中,Toll样受体(Toll like receptor,TLR)起着关键的作用,能够介导各种病原微生物引发的天然免疫反应。研究发现,在天然免疫反应中,Toll样受体通过其胞外区域识别病原微生物含有的不同病原相关分子模式,例如TLR2识别细菌脂蛋白,TLR4识别细菌脂多糖,TLR9识别细菌DNA等。通过临床观察研究发现,不同个体对病原微生物的易感性不同。同时,大量研究证实遗传因素可能是导致这一现象的原因。本课题组以前的研究,发现了一些模式识别受体的基因多态性和严重创伤病人对脓毒症的易感性和预后有明显的关联性,例如CD14、MD-2等。越来越多的研究发现,TLR2、TLR4和TLR9的基因多态性可能会影响个体对感染性疾病的易感性差异。因此,我们推测TLR2、TLR4和TLR9的一些基因多态性位点也许可以用以进行创伤病人的脓毒症和器官障碍的风险性评估。而目前国际上尚缺乏对创伤病人的TLR2、TLR4和TLR9的基因多态性临床关联研究。
　　 材料与方法:
　　 1、样本:本研究共收集557例严重创伤患者(创伤严重程度评分均大于或等于16分)血液样本。这些患者均为中国重庆汉族人群。其中男性449例,女性108例。其年龄平均为39.8岁,创伤严重程度评分平均为26分。
　　 2、生物信息学分析:从Hapmap数据库中获得研究区域内的中国北京人群的所有SNP基因分型数据。运用Haploview软件(4.0版)在整个TLR2和TLR9的基因范围内构建单倍域。再通过Tagger软件挑选单倍型标签SNP。
　　 3、单倍型标签SNP的基因分型:采用PCR-RFLP或焦磷酸测序的方法对SNP位点进行基因分型。
　　 4、细胞因子水平检测:取严重创伤患者入院后第一天全血。用ELISA方法检测血浆细胞因子表达水平。
　　 5、临床关联研究:脓毒症诊断标准:(1)有病原菌培养证据;(2)体温高于38.5℃或低于36.5℃;(3)白细胞计数高于10×109/L或低于4×109/L。根据患者氧合指数、血浆肌酐浓度、血浆胆红素浓度、血压调整后心率、血小板计数和格拉斯哥评分等变化计数器官功能障碍评分(MODS)。创伤ISS评分采用简明损伤定级标准(2005版)。
　　 6、数据统计分析:H-W平衡采用卡方检验计算。利用Haploview软件划分连锁不平衡区域。多态性与MODS评分、细胞因子表达水平间的关系采用单因素方差方法统计。等位基因计量效应采用线性回归分析统计,并用年龄、性别及ISS评分校正。显性及隐性遗传模式下各基因型与脓毒症发生率之间的关系采用卡方检验方法统计。等位基因计量效应采用多重Logister回归分析计算,并对年龄、性别及ISS评分校正。
　　 结果:
　　 1、生物信息学分析:通过对中国人群TLR2全基因范围内的SNP筛查,发现整个TLR2基因范围内可构建出2个单倍域,总共挑选出3个单倍型标签SNP位点(3013A/G,19216 T/C和22215 G/T)。在TLR9全基因范围内构建了1个单倍域,挑选出启动子区中的-1486 A/G位点作为标签SNP。
　　 2、创伤病人中的等位基因频率和基因型的分布:通过对410例创伤病人进行基因分型,发现TLR2基因中的3个单倍型标签SNP位点(3013 A/G,19216 T/C和22215 G/T)的最小等位基因频率(MAF)分别是39.5％、26.5％和47.4％。通过对303例创伤病人的基因分型,TLR4的-2242 T/C位点的MAF为42.9％。通过对557例创伤病人的基因分型,TLR9基因的4个重要SNP位点(-1486 A/G、1174 A/G、2849 C/T和6577 T/C)的MAF分别为38.8％、36.9％、37.7％和36.3％。-1237 T/C位点的MAF太低(0.8％)被排除出研究范围。这些SNP位点基因型频率均符合哈根平衡。
　　 3、SNP位点的多态性和细胞因子产生水平的关联性:通过统计,发现TLR2基因的3013 A/G、19216 T/C位点的多态性、单倍型ATT携带数量和外周血白细胞在细菌脂蛋白的刺激下产生细胞因子TNFα、IL-8和IL-10水平的能力有明显关联性。TLR4基因的-1486 A/G、2849 C/T、6577 T/C位点的多态性、单倍型GGTC携带数量和创伤后24小时内外周血中的TNFα水平相关。
　　 4、SNP位点的临床关联分析结果:发现TLR219216 T/C、TLR4.2242 T/C、TLR96577 T/C、TLR2基因ATT单倍型携带数量、TLR9基因GGTC单倍型携带数量和创伤病人的脓毒症发生率、器官功能障碍评分具有明显的相关性。
　　 结论:
　　 1、对于中国汉族人群,本研究在TLR2全基因范围内划分了2个单倍域,挑选出3个标签SNPs(3013A/G、19216T/C、22215G/T)。在TLR9全基因范围内构建了1个单倍域,挑选出启动子区中的-1486 A/G位点作为标签SNP。
　　 2、TL,R4的-2242 T/C位点、TLR2基因中的3个单倍型标签SNP位点(3013 A/G,19216 T/C和22215 G/T)和TLR9基因中的4个重要SNP位点(-1486 A/G、1174 A/G、2849 C/T和6577 T/C)在中国重庆汉族人群中存在,并且均为高频位点。TLR9的-1237T/C位点在此人群中以极低的频率出现。
　　 3、TLR2基因的3013位点A等位基因、19216位点C等位基因和野生型单倍型ATT也许能够减弱天然免疫细胞内的TLR2介导的免疫反应。TLR9基因的-1486位点G等位基因、2849位点T等位基因、6577位点C等位基因和单倍型GGTC可能会加强严重创伤后TLR9介导的天然免疫反应。
　　 4、TLR219216 T/C、TLR4-2242 T/C、TLR96577 T/C这三个SNP位点,以及TLR2基因ATT单倍型、TLR9基因GGTC单倍型也许可作为严重创伤后脓毒症易感性的一个重要早期预警指标,用于进行创伤病人的脓毒症和器官障碍的风险性评估。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词表

第一部分 TLR2全基因标签单核苷酸多态性的筛选及其临床意义

前言

实验一 在TLR2全基因范围内构建单倍域和挑选标签SNPs

材料与方法

结果

讨论

实验二 TLR2基因标签SNPs在重庆严重创伤人群中的发生频率分析

材料与方法

结果

讨论

实验三 TLR2基因标签SNPs对TNF-α、IL-8和IL-10分泌的影响

材料与方法

结果

讨论

实验四 TLR2基因标签SNPs与严重创伤病人预后的关系

材料与方法

结果

讨论

第二部分 TLR4基因启动子区-2242 SNP与严重创伤病人预后的关系

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 TLR9全基因的生物信息学分析及重要SNP位点的临床意义

前言

实验一 在TLR9全基因范围内构建单倍域和挑选标签SNPs

材料与方法

结果

讨论

实验二 TLR9基因重要SNPs在重庆严重创伤人群中的发生频率分析

材料与方法

结果

讨论

实验三 TLR9基因重要SNPs对创伤后即刻血浆中TNF-α水平的影响

材料与方法

结果

讨论

实验四 TLR9基因重要SNPs与严重创伤病人预后的关系

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 TLR2基因多态性和感染性疾病的关联性研究进展

参考文献

学习期间撰写及发表的论文