1,25-二羟维生素D3联合特异性免疫疗法对小鼠哮喘模型的作用及其机制

摘要

目的：
　　 支气管哮喘(简称哮喘)是常见的慢性呼吸道疾病之一。近年来，其患病率在全球范围内呈逐年增加的趋势。过敏性哮喘是在过敏原刺激下，由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性变应性炎症，其发病机制尚未完全阐明[1-3]。过敏性哮喘的特征为嗜酸性粒细胞浸润为主的气道炎症和气道高反应性[4，5]。其中，免疫-炎症反应是哮喘发病的重要机制，抗原通过抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)激活T细胞，活化的辅助性T细胞(主要是Th2细胞)产生白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13等进一步激活B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞及肺泡巨噬细胞等多种炎症细胞，造成气道炎症反应。因此，在过敏性哮喘中，过敏原通过APC激活T细胞是发生气道炎症的重要始动环节。
　　 特异性免疫疗法(specific immunotherapy，SIT)通常称为脱敏治疗。SIT为治疗过敏性支气管哮喘提供了不同于常规药物(如肾上腺糖皮质激素，氨茶碱和β2-受体激动剂等)的治疗方法，是目前已知唯一针对哮喘病因的治疗，成功的SIT可改变过敏性疾病的自然病程[6，7]。既往受到接种疫苗治疗传染性疾病获得巨大成功的启示，早在1911年，Noon和Freeman开始使用特异的过敏原治疗过敏性疾病[21]。从那时起，皮下SIT在临床治疗中逐渐得到发展和完善。近一个世纪，皮下SIT被认为是治疗过敏性疾病(例如，对昆虫毒液，屋尘螨，花粉或动物皮屑等过敏)的一种重要的治疗措施[8，9]。
　　 SIT的作用机制尚不完全清楚[10，11]。目前认为，SIT主要是通过改变机体的免疫状态而达到治疗过敏性疾病的作用，成功的SIT能够诱发过敏机体对特异性抗原产生耐受，期间诱导产生的调节性T细胞(T regulatory cells，Tregs)发挥了重要作用[10-14]。但是，由于脱敏治疗存在可能诱发过敏性不良反应(如严重的过敏性休克)、疗程长以及疗效个体差异较大等原因，影响了该疗法的临床应用[15]。因此，需要不断深入探讨改善SIT治疗过敏性哮喘的方法及其机制。
　　 1，25二羟维生素D3[1，25(OH)2D3，VitD3]是维生素D的活性代谢产物。VitD3除在骨形成和钙的代谢过程中具有重要作用外，还通过表达在APC和活化的T细胞中的特异性受体发挥免疫调节作用[16]。在与免疫调节相关的疾病研究中发现，VitD3不仅可以预防人类1型糖尿病[17]和炎症性肠病动物模型的发病[18]，还能够延长同种异体移植存活期，减轻急、慢性排斥反应[19]。VitD3还可诱导单核细胞源性不成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDCs)表面抗原呈递分子MHCⅡ和共刺激分子CD40，CD80和CD86的表达量下调，影响免疫过程[20]。
　　 鉴于在既往的研究中显示SIT和VitD3两者都有助于形成免疫耐受，可对变应性疾病发挥治疗作用，本实验观察了使用VitD3预处理联合SIT在使用卵蛋白(ovalbumin，OVA)致敏小鼠哮喘模型中对气道炎症、Th1/Th2相关的细胞因子分泌、OVA特异性IgE、小鼠脾源性DCs表面共刺激分子表达和对Tregs极化的作用；并探讨了使用rmIL-4、rmGM-CSF联合VitD3诱导骨髓源性树突状细胞(dendritic cells，DCs)，观察DCs在加用OVA和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激对髓源性DCs中Notch信号配体Jagged1和Jagged2表达的影响。为探讨使用VitD3作为佐剂，联合SIT治疗过敏性哮喘提供实验基础。
　　 方法：
　　 一、体内实验：探讨VitD3处理联合SIT对哮喘小鼠气道炎症的作用及其机制
　　 1.实验分组：使用BALB/c小鼠(6～8周龄，18～24g)75只，随机分为5组(15只/组)分别为正常对照组，哮喘模型组，VitD3处理组，免疫治疗组，VitD3+免疫治疗组(简称为，联合处理组)。其中复制OVA致敏(佐剂为氢氧化铝凝胶)-脱敏-激发的小鼠模型，作为小鼠哮喘模型，并使用H.E染色的方法鉴定。
　　 2.实验程序：模型制作和处理程序简述如下，除外正常对照组外，其余小鼠致敏使用OVA10μg+Al(OH)32 mg，分别于d0和d7进行腹腔注射。正常对照组使用PBS0.1 ml进行致敏。两周之后，除外正常对照组、哮喘模型组和VitD3预处理组之外，另外两组免疫治疗使用OVA100μg分别于d21、d23和d25，在尾根部进行皮下注射。正常对照组和哮喘模型组使用PBS0.1 ml，进行尾根部皮下注射。在每次进行OVA或PBS免疫治疗前24 h(d20，d22和d24)，除外正常对照组、哮喘模型组和免疫治疗组之外，其余两组预处理分使用VitD350 ng进行腹腔注射。10天之后，除外正常对照小鼠组，其余4组小鼠使用1％OVA的PBS溶液进行超声雾化吸入，每天30min，时间为d35、d38和d41。所有小鼠在最后一次雾化吸入24 h后即d42，进行各项检查。
　　 3.支气管肺泡灌洗：在最后一次激发24h后，收集上述各组中支气管肺泡灌洗液(BALF)，离心分离，获得的沉淀使用瑞氏-姬姆萨染色检测其中的细胞总数和分类；得到的上清液，使用ELISA检测气道炎症检测IL-4，IL-5，IL-10和IFN-γ水平。
　　 4.收集外周血：各组小鼠在进行最后一次激发后24h，采用眼球摘除法收集外周血，分离血清，使用ELISA检测血清中OVA特异的IgE(sIgE)水平。
　　 5.采集脾脏：分离、纯化各组脾脏中的DCs，使用流式细胞仪检测DCs表面的共刺激分子CD11c、CD80和CD86的表达情况；
　　 分离、纯化小鼠脾脏CD4+淋巴细胞细胞，流式检测各组小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的百分比值。
　　 4.留取肺标本：将各组中小鼠左肺上叶，10％福尔马林固定，组织切片后进行H.E染色。
　　 二、体外实验：探讨加用VitD3诱导骨髓源性DCs被OVA和LPS刺激后Jagged1和Jagged2的表达变化
　　 1.培养鉴定骨髓源性DCs：拉颈脱臼法处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨骨髓，使用rmIL-4(10 ng/ml)、rmGM-CSF(20 ng/ml)连续培养10d，诱导骨髓源性树突状细胞。通过导致光学显微镜观察、扫描电镜检查细胞形态，并使用流式检测DCs表面标志性分子(CD11c、CD80和CD86)的表达，鉴定小鼠骨髓源性DCs。
　　 2.检测VitD3对诱导骨髓源性DCs中Jagged1和Jagged2表达的变化
　　 实验分组：在未加用、加用VitD3培养出来的两类DCs中，根据培养后期加入的刺激物不同，各自分为对照组，OVA组，LPS组和OVA+LPS组。
　　 实验程序：如上方法制备小鼠骨髓细胞，以1×107/孔加入6孔培养板中，于0d每孔加入rmGM-CSF(20 ng/ml)、rmIL-4(10 ng/ml)，3d、5d和7d进行半量换液(同时补充rmGM-CSF、rmIL-4，在加用VitD3培养时，还要同时加入VitD3(1 nmol/L)。，8d加入OVA(100μg/ml)或/和LPS(1μg/ml)，9d再次半量换液(同时补充rmGM-CSF、rmIL-4，OVA或/和LPS)，48h后即d10收获细胞提取的mRNA和蛋白，使用RT-PCR和Western blotting法分别检测Jageed1和Jagged2的表达。
　　 结果：
　　 1.BALF中嗜酸性粒细胞计数：BALF中的嗜酸性粒细胞计数，在正常对照组为0.16±0.02×104/ml，哮喘模型组为21.84±2.91×104/ml，哮喘模型组比正常对照组显著增高(P<0.05)；VitD3组为15.73±1.69×104/ml，免疫治疗组为13.41±1.67×104/ml，联合处理组为7.46±1.34×104/ml，VitD3组和免疫治疗组分别与哮喘模型组相比BALF中的嗜酸性粒细胞计数虽有下降，但是均无显著降低(P>0.05)。联合处理组与哮喘组相比，则有显著降低(P<0.05)，联合处理组与免疫治疗组相比显著降低P<0.05)，但与正常对照组相比仍有显著增高(P<0.05)。
　　 2.肺部病理改变：肺组织切片进行H.E染色，与正常对照组小鼠肺脏相比较，哮喘模型组小鼠肺脏的体积增大、肿胀。可见支气管及血管周围有大量的炎性细胞浸润(以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主)。气管内皮部分脱落，基底膜增厚形态不规则；VitD3组或只免疫治疗组，可减轻小鼠肺组织的气管基底膜增厚、大量炎症细胞浸润和气道上皮脱落；联合处理组炎症细胞浸润和气道上皮损伤明显减轻。
　　 3.血清中sIgE水平：检测小鼠血清中sIgE发现，正常对照组为0.16±0.05 ODunits，哮喘模型组为0.93±0.08 OD units，哮喘组比正常对照组显著增高(P<0.05)；VitD3组为0.644±0.07 OD units，免疫治疗组为0.75±0.06 OD units，联合处理组为0.42±0.06 OD units，VitD3组和免疫治疗组分别与哮喘模型组相比血清中的IgE水平虽有下降，但是均无显著降低(P>0.05)。联合处理组与哮喘组相比，则有显著降低(P<0.05)，联合处理组比免疫治疗组显著降低(P<0.05)，但与正常对照组相比仍有显著增高(P<0.05)。
　　 4.BALF中细胞因子水平：检测小鼠BALF中IL-4水平，正常对照组为31.51±8.32pg/ml，哮喘模型组为58.24±12.51 pg/ml，哮喘组比正常对照组显著增高(P<0.05)；VitD3组为57.43±8.91 pg/ml，免疫治疗组为43.75±6.42 pg/ml，联合处理组为7.63±7.87pg/ml，VitD3组、免疫治疗组和联合处理组分别与哮喘模型组相比BALF中的IL-4水平虽有下降，但是均无显著降低(P>0.05)。
　　 BALF中IL-5水平，正常对照组为28.72±5.86 pg/ml，哮喘模型组为74.62±14.22pg/ml，哮喘组比正常对照组显著增高(P<0.05)；VitD3组为63.35±11.76 pg/ml，免疫治疗组为49.14±17.35 pg/ml，联合处理组为39.97±11.93 pg/ml，VitD3组和免疫治疗组分别与哮喘模型组相比，BALF中的IL-5水平虽有下降，但是均无显著降低(P>0.05)。联合处理组与哮喘组相比，则有显著降低(P<0.05)。
　　 BALF中IL-10水平，正常对照组为42.40±9.54 pg/ml，哮喘模型组为37.61±7.63pg/ml，哮喘组比正常对照组虽有下降，但无显著降低(P>0.05)；VitD3组为54.33±17.21 pg/ml，免疫治疗组为44.62±13.81 pg/ml，联合处理组为67.14±12.57pg/ml，VitD3组和免疫治疗组分别与哮喘模型组相比，BALF中的IL-10水平虽有上升，但是均无显著升高(P>0.05)。联合处理组与哮喘组相比，则有显著升高(P<0.05)。
　　 5.脾源性树突状细胞表面共刺激分子CD80和CD86表达：脾源性DCs表面共刺激分子CD80，在正常对照组为72.26±3.24％，哮喘模型组为85.37±4.06％，哮喘模型组比正常对照组CD80的表达显著上调(P<0.05)；VitD3组为68.71±8.72％，免疫治疗组为75.27±5.13％，联合处理组为64.46±2.75％，VitD3组和免疫治疗组中CD80比哮喘模型组表达均有降低，但无显著降低(P>0.05)，只有联合治疗组比哮喘模型组显著降低(P<0.05)。
　　 脾源性DCs表面共刺激分子CD86，在正常对照组为70.41±7.23％，哮喘模型组为80.72±9.47％，哮喘模型组比正常对照组CD80的表达无显著上调(P>0.05)；VitD3组为57.82±6.21％，免疫治疗组为64.75±4.28％，联合处理组为50.14±3.51，VitD3组和免疫治疗组中CD86表达比哮喘模型组均有降低，但无显著降低(P>0.05)，只有联合治疗组比哮喘模型组显著降低(P<0.05)。
　　 6.脾源性CD4+CD25+Foxp3+T：检测脾源性CD4+CD25+Foxp3+T占CD4+T细胞的百分比值，正常对照组为5.45±0.63％，哮喘模型组为3.61±0.47％，哮喘模型组比正常对照组显著降低(P<0.05)；VitD3组和免疫治疗组均较哮喘组百分比值上升，但均无显著增加(P>0.05)；联合处理组百分比值为5.22±0.53％，较哮喘组显著增高(P<0.05)。
　　 7.骨髓源性树突状细胞中Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白的表达
　　 不加VitD3，只常规使用rmGM-CSF和rmIL-4诱导小鼠BMDCs，经OVA和LPS进行诱导48h之后，检测Jagged1 mRNA的表达，结果显示：OVA组、LPS组比对照组Jagged1的mRNA表达均有增加，但无显著性差别(P>0.05)，OVA+LPS组比对照组Jagged1的mRNA表达显著增加(P<0.01)。与Jagged1的表达相似，在OVA组、LPS组比对照组，Jagged2的mRNA表达均有增加，但无显著性差别(P>0.05)，OVA+LPS组比对照组Jagged2的mRNA表达显著增加(P<0.01)。
　　 加用VitD3与rmGM-CSF、rmIL-4共同诱导的小鼠BMDCs，经OVA和LPS进行诱导48 h之后，检测Jagged1和Jagged2 mRNA的表达，结果显示，OVA组、LPS组和OVA+LPS组与对照组相比，均略有升高，但无统计学差异。
　　 在无VitD3处理后的BMDCs在使用OVA刺激时，在150KDa和130KDa处分别可见Jagged1、Jagged2蛋白表达条带，两组比和对照组表达量略有增多，OVA+LPS组Jagged1和Jagged2蛋白表达明显增加；加用VitD3后，OVA组、LPS组和OVA+LPS组Jagged1和Jagged2蛋白表达和对照组PBS刺激相比，均无明显增加。
　　 结论：
　　 1.在小鼠OVA致敏哮喘模型中，使用VitD3预处理能够增强SIT的治疗作用，表现为减轻哮喘气道的炎症，纠正Th1/Th2偏移，使脾源性DCs共刺激分子CD80、CD86表达降低以及诱导Tregs增加。
　　 2.在使用VitD3联合rmIL-4，rmGM-CSF联合诱导小鼠髓源性DCs后，加用OVA，LPS刺激，可明显降低DCs表面Notch配体Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白的表达。Jaagged1和Jagged2表达的降低，可能是VitD3参与免疫调节机制之一。
　　 本文的结果证明，使用VitD3处理可增强SIT对OVA致敏小鼠模型所致变应性的炎症治疗作用，有助于免疫耐受的形成；通过对VitD3体外诱导髓源性树突状细胞接受OVA和LPS刺激后的检测证明，VitD3有可能通过降低Notch配体在髓源性DCs表面Jagged1和Jagged2的表达，而发挥免疫调节作用的。