Herpesvirus Entry Mediator/CD160介导人调节性T细胞对CD4+效应性T细胞的抑制作用

摘要

研究背景：器官移植现已作为治疗器官功能衰竭的有效措施，然而器官移植后各种类型的移植物排斥反应仍然是器官移植的主要障碍之一。移植排斥反应的始动环节是机体针对同种异体抗原的T细胞活化与增殖，而协同刺激信号系统是T细胞活化的必要条件。随着研究的深入人们发现：协同刺激信号系统内，除存在一类能刺激细胞活化的共刺激分子外，还存在另外一类抑制细胞活化的共抑制分子。现已有多种动物移植模型及临床研究显示：阻断或者激活某条协同刺激通路后可明显抑制效应性T细胞活化增殖，减少各种移植排斥反应，延长移植物生存时间。HVEM(Herpesvirus EntryMediator)/CD160为近年来新发现的共抑制分子配/受体，研究发现激活小鼠CD4+T细胞HVEM/CD160通路能显著抑制小鼠CD4+效应性T细胞(Effective T cells，Teffs)的活化增殖及IL-2等细胞因子的产生，从而延长移植心脏的存活时间。CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)作为一群特殊的T细胞亚群，具有抑制效应性T细胞活化、增殖及细胞因子产生的作用，从而参与机体免疫调节。同时，CD4+CD25+调节性T细胞表面也有大量协同刺激分子的表达。这些协同刺激分子对于Treg的发育、成熟以及免疫抑制功能密切相关。有研究认为Treg 可能通过这些协同刺激分子而抑制效应性T细胞活化、增殖及细胞因子的产生。Cai等的研究发现小鼠CD4+CD25+调节性T细胞表面高表达HVEM分子。在敲除HVEM基因后， CD4+CD25+Treg的上述免疫抑制作用明显减弱。上述研究提示Treg 可能通过HVEM/CD160介导了对Teffs的免疫抑制作用。另有研究发现人CD4+T细胞表面也有HVEM、CD160表达，然而它们在CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25—Teffs的具体表达情况，以及它们对调节性T细胞免疫抑制功能的影响并未深入研究。
　　 目的:
　　 本实验通过免疫磁珠分选法分选高纯度人CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25—Teffs，并研究HVEM、CD160在不同CD4+T细胞亚群、不同功能状态下的表达；同时研究HVEM/CD160通路对CD4+CD25+调节性T细胞功能基因Foxp3的表达及其免疫调节作用的影响。
　　 方法:
　　 1.CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs的分选及分选纯度鉴定：
　　 采用浓度梯度离心法，从浓缩白细胞(白膜)中提取外周血单个核细胞(PBMC)。将提取的PBMC 悬液按CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit 说明，进行一次CD4+T细胞的阳性分选及两次CD25+Tregs的阴性分选，得到CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs。分选的CD4+CD25+Tregs 经破膜处理后，行胞内Foxp3 染色及CD4、CD25表面分子染色。最后通过流式细胞分析技术分析免疫磁珠分选的CD4+CD25+Tregs的纯度。
　　 2.流式细胞术检测CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs不同功能状态下HVEM/CD160表达：
　　 将免疫磁珠法分选的CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-T细胞分别培养于U 型底96孔培养板内，同时加入与细胞数量相等的Dynabeads Huamn T-Activator CD3/CD28磁珠，及300单位/mL浓度的人重组IL-2作为刺激因素。于培养刺激第0天、3天、5天三个时间点分别对CD4+CD25+Tregs细胞的HVEM及CD4+CD25-T细胞的CD160进行胞外染色，通过流式细胞分析技术分析两种分子在各自细胞表面的表达情况。
　　 3.RT-PCR 检测Treg Foxp3表达：
　　 采用HSV1gD蛋白阻断CD4+CD25+Tregs HVEM/CD160后，通过RT-PCR 技术检测其Foxp3基因的表达情况。
　　 4.3H-TdR 掺入法检测CD4+CD25+Tregs细胞免疫抑制功能：
　　 分选的CD4+CD25+Tregs 经不同浓度梯度的HSV1gD蛋白阻断HVEM/CD160处理后，与等量CD4+CD25-Teffs 混合共培养，然后行3H-TdR 掺入法检测共培养体系的增殖效率：CPM值。
　　 结果:
　　 1.采用免疫磁珠分选法分选的CD4+CD25+Treg细胞得率较高，分选细胞存活率为：95.65±1.92％，细胞活力好。通过流式细胞分析技术对其纯度进行鉴定：CD4、CD25分子双阳性细胞占分选细胞总数的91.23％；而CD4、CD25、Foxp3 三阳性细胞，即是CD4+CD25+Foxp3+Treg 占分选细胞总数的70.55％。
　　 2.HVEM在初始Treg呈中度表达，且随着Treg的活化，其表面HVEM分子表达率上调，与活化前比较差异具有统计学意义(p＜0.05)；其配体CD160分子在初始CD4+CD25-T细胞呈低表达状态，且随着CD4+CD25-T细胞的活化其表达CD160升高，与活化前比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 3．实时荧光定量PCR 结果显示：经HSV1gD蛋白阻断HVEM—CD160通路后Treg的Foxp3基因表达率降低，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(p＜0.01)。
　　 4.3H-TdR 掺入实验结果显示：免疫磁珠分选的CD4+CD25+Treg 经不同浓度的gD蛋白处理，阻断HVEM—CD160通路后其免疫抑制作用明显降低，处理组细胞增殖明显高于空白对照组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，且细胞增殖程度呈浓度依赖性升高。
　　 结论:
　　 1.HVEM分子表达于Treg表面，而其配体CD160分子表达于Teff。随着两种细胞的活化，两种分子各自表达上调。
　　 2.Treg表面表达的HVEM分子与Teff表达的CD160结合后可上调Treg Foxp3基因的表达。
　　 3.Treg通过表达的HVEM作用于表达CD160的Teff。其可能作为Treg细胞—
　　 细胞接触分子机制之一而参与对Teff的抑制。
　　 综上所述，活化的CD4+CD25+Treg 可能通过上调HVEM，与CD4+CD25-Teff表面上调的CD160分子交联，促进Treg Foxp3的表达，从而增强Treg的免疫调节作用。
　　 Treg表面HVEM与Teff表面CD160的交联，也可能作为Treg细胞—细胞接触的分子机制之一而介导了Treg对Teff的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 免疫磁珠分选法分离人外周血中CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25- T 细胞及其鉴定

第二部分 流式细胞术检测CD4+CD25+ Treg 及CD4+CD25-T 细胞不同功能状态下HVEM/CD160 表达

第三部分 HVEM/CD160 对CD4+CD25+Treg 免疫抑制功能及对Foxp3 表达的影响

全文结论

致 谢

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参考文献

文献综述 协同刺激分子在器官移植中的新进展

在读期间发表的文章及参加的会议