胆汁淤积时肝组织线粒体功能改变及mtDNA损伤的临床分析

摘要

线粒体是提供和存储能量的重要场所，是细胞生命活动的动力站。线粒体DNA（mitochondriAlDNA，mtDNA）是核外唯一具有遗传效应的物质，具有自我复制功能并控制着一定的遗传性状。线粒体损伤可引起一系列的细胞功能障碍，线粒体的功能改变及基因组的突变缺失与疾病进程有着密切的关系。梗阻性黄疸（obstructivejaundice，OJ）是临床上常见的疾病，多由结石和肿瘤引起，常常需要采用外科治疗。
　　 胆汁淤积时，氧自由基通过脂质过氧化作用于线粒体蛋白、膜脂及mtDNA 而出现ATP酶活性降低，脂质过氧化产物蓄积，mtDNA 碱基序列改变（缺失及突变），拷贝数减少，最终引起能量代谢障碍而促进肝细胞死亡。故而线粒体作为胆汁淤积时肝细胞内最先受损害的细胞器，以及影响线粒体功能的最基本因素-mtDNA 由于缺乏有效的保护和修复能力等因素而易遭损害，线粒体功能便成了决定肝细胞功能的重要因素。所以我们通过对mtDNA 缺失损伤的初步临床分析及线粒体的功能改变的研究，为进一步揭示mtDNA 缺失致肝功能改变提供新的思路，这不仅有助于我们更加深刻的理解和完善胆汁淤积的损伤机制，而且为重度梗阻性胆汁淤积的早期治疗和预后评估开辟新的途径。
　　 目的：（1）通过对mtDNA 缺失及突变的临床分析，并结合前期自然基金的研究结论，初步判定mtDNA在梗阻性黄疸患者肝组织中的损伤情况，为探讨mtDNA 损伤致胆汁淤积性肝损害提供新的思路。（2）通过对胆道梗阻不同时间点肝线粒体功能学指标的检测，以探讨线粒体功能损害与基因缺失的相关情况。
　　 方法：（1）严格按照入组条件随机选取好对照组和病例组，利用17对相互错配重叠的引物进行PCR 扩增，并结合基因测序对梗阻性黄疸患者肝细胞mtDNA的缺失及突变情况进行初步定位。（2）制备梗阻性黄疸大鼠模型，设立对照组、SHAM组和BDL组，利用Elisa 检测线粒体ATP 酶及脂质过氧化产物MDA的改变情况。
　　 结果：（1）通过多对引物扩增并结合测序结果分析，梗阻性黄疸患者部分肝细胞mtDNA分别出现碱基位置8429～9591处约1.1kb的缺失，16024～60处约0.6kb的缺失，1889～3031处约1.1kb的多片段缺失以及D-loop 区部分碱基的高突变率；同时部分细胞mtDNA在8470～8482bp和13447～13459bp 之间出现了4977bp 片段的共同缺失。（2）随着梗阻时间延长，较之对照组而言，BDL组MDA在肝脏线粒体内逐渐潴留（p<0.05），于14d时出现不可逆改变（p<0.05）；而ATP 酶活性逐渐降低（p<0.05），于14d时降至最低（p<0.05），但在梗阻早期（1-3d），ATP 酶活性下降不明显（p>0.05）。
　　 结论：胆道梗阻时，由于胆汁排出受阻，组织缺血缺氧，过氧化作用增强而生成的大量氧自由基。后者通过脂质过氧化作用对线粒体膜脂、膜蛋白及mtDNA造成损伤，表现为：MDA在线粒体内蓄积，Na+-K+-ATP酶活性降低，线粒体功能受到损害；除此之外，肝细胞线粒体基因组由于缺乏有效的组蛋白保护以及缺乏对氧自由基的有效清除能力而易受损，部分细胞mtDNA出现了多片段缺失及部分碱基的突变。这与前一国家自然基金的动物研究结果基本相仿。因而我们认为：胆汁淤积时，MDA的潴留对mtDNA的损伤起到积极的作用，是造成肝细胞线粒体功能以及肝功能受损的重要因素。因而积极有效地清除MDA及保护mtDNA的功能性和完整性也将成为今后研究的重点，这也为研究梗阻性黄疸肝功能的损伤机制及保护手段提供了新的思路，为临床上保护及改善梗阻性黄疸围手术期肝功能提供了帮助。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分梗阻性黄疸患者mtDNA损伤缺失及突变分析

第二部分胆汁淤积对线粒体ATP酶和脂质过氧化产物MDA的影响

全文结论

致谢

参考文献

文献综述线粒体在胆汁淤积性肝损害中的作用

攻读硕士学位期间发表的论文