可注射型抗感染组织工程骨治疗兔胫骨感染性骨缺损研究

摘要

背景和目的：慢性骨髓炎的治疗是骨科临床中治疗的难点。这主要是因为：骨感染发展成慢性感染后，骨组织及邻近的软组织破坏严重，局部血运差，目前常规的全身应用抗生素很难在感染局部达到有效的治疗浓度，导致致病菌难以被杀灭；此外，慢性骨髓炎对骨组织破坏严重，导致骨质硬化和死骨形成，清创后局部残留巨大的骨组织空腔，由于一期植骨并发再次骨感染而导致移植失败发生率高，目前大多选择二期植骨，这样就延长了治疗时间，增加了患者的痛苦。但是，伴随着抗生素局部缓释技术和骨组织工程技术的快速发展，给慢性骨髓炎这一古老而又棘手的疾病的救治带来了新的希望。我们期望通过以纤维蛋白胶为支架的、复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型组织工程骨来实现在局部的抗感染和促进成骨，从而实现慢性骨髓炎的彻底治愈。为此，本研究主要目的包括：(1)制备兔慢性骨髓炎模型；(2) 检验以纤维蛋白胶为支架的、复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型组织工程骨的体外生物学特性；(3)利用已建立的慢性骨髓炎模型检测以纤维蛋白胶为支架的、复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型组织工程骨体内的治疗感染和成骨能力。
　　 方法：(1)通过微创的骨髓穿刺针方法制备兔慢性骨髓炎模型，并通过放射影像学、组织病理学和细菌学等方法评价骨髓炎模型的科学性和稳定性。(2)通过密度梯度离心结合贴壁培养法分离、纯化、获得兔骨髓间充质干细胞，通过成骨、成软骨以及成脂肪诱导分化检测其多方向分化潜能并实现其鉴定。(3)将兔骨髓间充质干细胞通过逆转录病毒pLEGFP-N1标记后，在激光共聚焦下观察标记了增强型绿色荧光蛋白的间充质干细胞在可注射支架纤维蛋白胶中的分布情况，通过生长曲线和碱性磷酸酶的检测评价种子细胞间充质干细胞在复合物中的增殖和成骨分化情况。(4)通过已构建的兔胫骨慢性骨髓炎模型检验复合万古霉素藻酸盐缓释系统的以纤维蛋白胶为支架的可注射型抗感染组织工程骨在局部的抗感染和成骨能力。再将构建好的慢性骨髓炎模型感染部位行彻底清创术之后，将可注射型抗感染组织工程骨移植到胫骨干骺端骨缺损处，通过放射影像学、组织病理学和细菌学检测可注射型抗感染组织工程骨在体内的抗感染能力和局部成骨能力。结果：(1)通过微创的骨髓穿刺针方法建立兔慢性骨髓炎模型，术后4周影像学显示，有明显的慢性骨髓炎的X 线表现：软组织炎症反应，死骨形成，骨硬化，骨膜反应，其X 线Norden 骨髓炎评分显示，最高分5分，最低分2分，平均值±标准差为3.6±0.8。组织病理学显示存在伴有明显骨吸收和死骨形成的化脓性病灶。细菌学结果提示每只动物近端、中段、远端的骨组织内均培养出ATCC 25923 金黄色葡萄球菌，标本细菌计数的均值为(6.8±0.2)×109 CFU/g。(2)通过密度梯度离心结合贴壁培养法分离、纯化、获得了兔骨髓间充质干细胞，通过成骨、成软骨以及成脂肪诱导液诱导21天后经过骨钙素免疫组化染色以及茜素红和von Kossa 病理染色证实分化为成骨细胞，通过Ⅱ型胶原免疫组化染色证实分化为软骨细胞，通过油红O 染色证实分化为脂肪细胞。(3)用逆转录病毒pLEGFP-N1成功标记兔骨髓间充质干细胞，在激光共聚焦下观察标记了增强型绿色荧光蛋白的间充质干细胞在可注射支架纤维蛋白胶中的均匀分布，生长曲线和碱性磷酸蛋白酶的检测结果显示种子细胞间充质干细胞可在复合物中很好的增殖和成骨分化。(4)以纤维蛋白胶为支架的复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型抗感染组织工程骨移植慢性骨髓炎骨缺损模型的感染部位之后，放射影像学和组织病理学显示复合物可以有效的控制感染，术后3月无明显的感染病灶存在，同时新生的骨小梁较对照组明显；细菌学检测显示实验组的标本内的每克组织内的细菌数较未放置万古霉素缓释微球的对照组而言显著减少(p<0.05)。
　　 结论：(1)通过改良的方法成功制备了兔慢性骨髓炎模型，降低了感染的不稳定率及动物的死亡率，该模型具有稳定、科学、重复性好的特点；(2)逆转录病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)成功感染间充质干细胞(BMSCs)，激光共聚焦显微镜下显示种子细胞在支架内均匀分布；(3)生长曲线和碱性磷酸酶的检测显示在复合物内种子细胞可以很好地增殖和成骨分化；(4)以纤维蛋白胶为支架、复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型抗感染组织工程骨在兔胫骨慢性骨髓炎骨缺损模型体内局部可以很好的杀灭细菌，减少骨髓炎的复发；同时，一期移植的组织工程骨复合物可以促进局部的成骨修复重建，实现骨感染合并骨缺损的一期同时修复，为寻找更为安全有效的处理慢性骨髓炎骨缺损的病例拓展新思路，完善新技术，提供新理论。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

主要参考文献

主要实验方法

第一部分 兔慢性骨髓炎骨缺损模型的建立及评价

第二部分 可注射型抗感染组织工程骨中种子细胞的培养和成骨分化

第三部分 可注射型抗感染组织工程骨治疗兔胫骨感染性骨缺损

全文总结

致 谢

照 片

文献综述 慢性骨髓炎的局部缓释治疗

攻读硕士学位期间发表的论文及会议交流论文