Rgg转录调节因子对高致病性2型猪链球菌毒力与代谢的调控研究

摘要

2 型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, SS2)是一种重要的人畜共患传染病病原体, 可引起人和猪的脑膜炎、关节炎、肺炎、败血症甚至急性死亡，长期以来给养猪业和相关从业人员健康均形成巨大威胁。在本课题组报道中国暴发的两起大规模人感染SS2的公共卫生事件之前，世界各地报道的人感染SS2 病例均为散发。流行病学调查结果显示，SS2 感染现已在中国形成暴发与散发共存的流行趋势。我们通过比较基因组学分析证实，在中国引发两次大规模感染的SS2 强毒株基因组中均带有一段89 kb 长的DNA 片段，命名为89K，进一步的生物信息学分析表明89K 可能具有毒力岛的功能。近年来，对SS2 致病性的研究越来越受到各国学者的重视，因此目前除了一些传统已知的毒力因子如荚膜多糖和溶血素之外，也有一些新的毒力相关元件得以鉴定，如二元信号转导系统SalK-SalR、孤儿调控因子CovR、脂膜酸，等等。
　　 同其它很多致病菌一样，SS2通过空气传播在动物的扁桃体定植，随后突破免疫系统屏障，并通过血液循环扩散到全身。为了在宿主体内的不同器官中定植和生存，SS2 必须感受外界不断变换的环境，高效率地产生响应，从而精准地调控特定基因的表达。由于随时要涉及到众多基因的协同作用，因此对细菌来说最有效率的方式莫过于通过众多转录调控因子的相互作用，形成一个精密的全局调控网络来大批量地调控整个基因组的表达。经过长期的研究，现在人们对化脓链球菌的全局调控网络已经有了很深入的认识，但是对于SS2 来说这方面的研究还很有限。Rgg家族的转录调节因子广泛分布于各种革兰氏阳性菌中，包括化脓链球菌、格氏链球菌、乳酸乳球菌等等。Rgg家族的N 端带有一个螺旋－转角－螺旋(HTH)的基序，以及对其发挥基因转录调控功能所必需的3个氨基酸保守残基。从目前的报道来看，Rgg家族的调控因子在不同的细菌中执行多种功能，例如控制葡萄糖代谢的通路，或者胞外蛋白的分泌，细菌素的表达，以及细菌对酸性环境的耐受等。实际上，化脓链球菌中的Rgg 调节因子还具有对基因组进行全局调控的功能，并能够与该菌中的其它调控系统协同作用，调节细菌的代谢、生长和毒力等多种生命活动，使其能在不同的环境存活。
　　 本研究在SS2中国强毒株05ZYH33中鉴定了一个属于Rgg家族的转录调节因子，并深入探讨了其调控功能和分子机制。具体实验内容如下：
　　 1.对05ZYH33中rgg基因的鉴定、克隆和原核表达：经生物信息学分析发现，05ZYH33基因组中的rgg基因编码一个287 aa的蛋白质，在其N 端有一个负责结合DNA的HTH基序，以及在Rgg家族调节因子中极度保守的3个氨基酸残基，而且其氨基酸序列与其它革兰氏阳性菌中的Rgg家族蛋白有较高的一致性。此外，我们利用pET-32a 原核表达系统对rgg基因进行了体外表达，发现纯化的重组蛋白可形成同质二聚体，该结果与文献报道的其它Rgg蛋白家族成员的特性相一致。
　　 2.Rgg基因的敲除与功能互补：我们先将壮观霉素抗性基因(SpcR)克隆至pUC18质粒的多克隆位点上，形成重组质粒pUC18-Spc，然后分别将rgg基因上下游的两个DNA 片段克隆到pUC18-Spc 质粒上SpcR基因的两侧，得到敲除载体pUC::rgg。将pUC::rgg 质粒电转化05ZYH33 感受态细菌，筛选具有壮观霉素抗性的SS2菌落，采用组合PCR、Southern 杂交和RT-PCR等方法验证Rgg 编码基因已被SpcR基因所替换，从而获得具有壮观霉素抗性的Rgg基因敲除突变株?rgg。随后，PCR 扩增出rgg基因及其上游启动子序列，克隆至大肠杆菌－猪链球菌穿梭质粒pSET1中，将重组质粒电转化突变株?rgg的感受态，通过双抗性筛选和RT-PCR 鉴定获得Rgg 功能互补株C?rgg。
　　 3.Rgg 缺失对05ZYH33 微生物表型和毒力的影响：在相同培养条件下观察野生株05ZYH33与?rgg 突变株在生物表型上差异。首先，通过革兰氏染色与透射电镜观察，发现突变株△rgg的链显得更长，细胞分裂发生异常，形成了一些大小不一的子细胞，而且有的细胞形态发生了改变，两端变尖呈梭形。其次，我们通过测OD600值绘制生长曲线发现，△rgg在生长的前9小时内大约比野生株约慢40％；但通过细菌涂板计数绘制却发现在生长前9个小时中二者无明显差异，当野生株进入静止生长期，突变株继续生长直到二者的OD600值达到一致。第三，突变株△rgg的溶血活性和对Hep-2细胞的粘附性都显著增强，仔猪感染实验证明，△rgg对动物的致死率明显下降，对两组死亡动物的病理学观察也显示突变株所致动物组织的病变程度明显更轻。因此，Rgg 缺失突变实际上导致SS2对仔猪的致病性减弱。在功能互补株C?rgg中，上述生物学性状均恢复得近似于野生株。
　　 4.突变株△rgg和野生株05ZYH33的基因表达差异研究：应用基因芯片和荧光定量PCR等技术，我们从转录水平比较了野生株和突变株的基因表达差异，发现Rgg缺失突变改变了345个基因的转录水平，占05ZYH33总基因数的15.87％，其中195个基因转录上调，150个基因下调。上述基因可按功能大致分为以下几类：(1)上调的基因主要涉及蛋白质的合成与修饰、DNA 复制与修复、细菌的防御机制等；(2)下调的基因主要是关于糖代谢方面的，尤其是各种非葡萄糖糖类的代谢过程；(3)一些与细胞的分裂繁殖和形态密切相关的基因改变了转录水平，可能导致了△rgg的镜下形态发生明显变化；(4)其中共有29个基因编码已知或预测的转录调控系统，说明Rgg是SS2基因表达调控网络的一部分，可与其它调控系统相互作用，共同响应胞外信号发挥精确的全局调控功能。
　　 综上所述，本研究通过基因敲除获得SS2中国强毒株05ZYH33的Rgg 缺失突变株，并结合基因芯片数据和实验结果，在转录水平分析突变株与野生株的基因表达差异，鉴定Rgg 转录调节因子控制的下游基因，证明Rgg在SS2基因组中发挥了全局性的转录调控功能，能够在SS2的感染过程中上调各种非葡萄糖糖类代谢基因的转录水平，改变细菌的糖代谢谱，同时下调一些非必需蛋白的表达，从而有助于SS2 适应宿主内环境，能够在新的营养条件下生存繁殖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表、氨基酸缩写

声明

前言

第一章05ZYH33中rgg基因的生物信息学分析及原核表达

第二章rgg基因敲除株的构建与鉴定

第三章Rgg缺失对SS2强毒株05ZYH33表型的影响

第四章利用基因芯片鉴定Rgg转录调控因子的功能

全文总结

致谢

参考文献

文献综述2型猪链球菌研究进展

攻读博士学位期间发表的文章及申请的专利