仿生化硅橡胶羟基磷灰石涂层材料的制备性能检测

摘要

研究背景和目的：
　　 软组织生物材料填充是整形外科临床治疗的主要手段之一，它主要应用于先天性或后天性各种原因所造成的体表组织器官畸形或缺损的矫正与修复。目前，临床常见的软组织填充材料主要有硅橡胶(silicone rubber，SR)、羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、膨体聚四氟乙烯(expended polytetrafluoroethylene，ePTFE)、高密度聚乙烯(high Density Polyethylene，HDPE)等。其中，SR具有良好的柔韧性和力学性能，稳定的理化性能，还有无毒、无味、不致癌等特性，可以长期植入体内而不被体液腐蚀。但SR表面呈强烈的疏水性，生物相容性较差，使组织细胞无法粘附生长而在其表面形成包膜，在时间和外界刺激的影响下，可能发生挛缩，致使植入体硬化、变形，甚至排出体外、造成感染等。HA则具有良好的生物活性和组织相容性，在植入人体后，能够迅速与周围组织细胞相结合，可以避免排异反应的发生。但是HA的脆性大、力学性能差、加工和塑形都比较困难，所以常被填充在受力较低的部位或加工成颗粒用于制作涂层材料或复合材料，应用范围受限。其余材料均各有利弊，因此，对新型材料的研发和现有材料的改性一直是整形外科的研究热点，并且任何一种新型材料的推广都必将大幅度提升整个医疗行业的技术水平。
　　 在整形外科手术中，存在一些不需要对材料进行雕刻的情况，或只须按照组织缺损范围对材料进行边缘修剪即可。基于上述需求，我们在课题研究中，将HA颗粒通过涂层的方法涂覆于SR表面，制备出新型涂层材料，使其既保留了SR良好的生理惰性和稳定的理化性能，且拥有HA极佳的细胞粘附能力和良好的生物相容性。同时，参照国家生物医用材料标准，对涂层材料进行力学性能、表面理化性能和体外细胞生物学相容性等方面的检测与评价。
　　 研究方法：本研究分为三部分：
　　 第一部分：制备涂层材料并进行形貌观察
　　 根据双组份液态硅橡胶室温固化的时间，将两种粒径的羟基磷灰石颗粒HA-1(粒径40μm)和HA-2(粒径150μm)分别喷涂于硅橡胶表面，制备出涂层材料HA-1/SR和HA-2/SR，并使用扫描电镜对其微观结构进行观察。
　　 第二部分：材料的理化性能及力学性能检测
　　 使用傅立叶红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer，FTIR)、X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)检测纯SR、HA-1/SR、HA-2/SR表面的理化性能；根据医用硅橡胶的国家标准要求，用邵氏硬度计和电子万能试验机检测各组材料的力学性能，进行统计学处理。
　　 第三部分：材料的体外生物学功能检测
　　 1.应用体外培养法培养小鼠胚胎成纤维3T3细胞和原代人真皮成纤维细胞；
　　 2.实验分组：
　　 1)正常组：未经修饰的培养瓶中生长的细胞；
　　 2)凋亡组：培养瓶中甲醛固定的细胞；
　　 3)纯SR组：纯SR材料表面生长的细胞；
　　 4)HA-1/SR组：HA-1/SR材料表面生长的细胞；
　　 5)HA-2/SR组：HA-2/SR材料表面生长的细胞。
　　 3.将人真皮成纤维细胞接种于各组材料表面培养48h，通过激光共聚焦显微镜观察细胞的骨架结构及粘附情况；采用CCK-8计数法检测成纤维细胞在各组材料表面的增殖情况及细胞毒性；Hoechst33342和PI双染法分析材料表面细胞的凋亡及坏死情况；
　　 4.分别运用Real-time PCR和Western blot检测材料表面生长的3T3细胞中影响细胞粘附功能的纽蛋白(vinculin)和骨桥蛋白(OPN)的mRNA及蛋白表达。
　　 研究结果
　　 1.利用SR的固化规律，成功制备了HA/SR涂层材料。使用扫描电镜观察HA-1/SR和HA-2/SR涂层材料中HA颗粒较均匀的分布在SR表面。
　　 2.FTIR、XPS分析显示，HA-1/SR和HA-2/SR涂层材料中HA与SR本身化学键合未被破坏。同时，在体外力学测试中，纯SR组、HA-1/SR组和HA-2/SR组的邵氏硬度分别为31±2.05度、28.14±1.83度、26.85±1.26度；抗拉强度分别为2.97±0.6Mpa、1.88±0.12 Mpa、1.63±0.15 Mpa；断裂伸长率分别为450.62±63.89％、327.76±15.72%、309.16±15.92%。
　　 3.激光共聚焦显微镜观察HA-1/SR组和HA-2/SR组材料表面生长的细胞与正常组相比，细胞骨架发生了重排；而纯SR组材料表面细胞中微丝排列稀疏且有回缩迹象。
　　 4.CCK-8法检测材料表面细胞的增殖情况及细胞的毒性，结果显示，正常组、纯SR组、HA-1/SR组和HA-2/SR组的吸光度(OD)分别为1.0539±0.0314、0.8511±0.0381、1.3877±0.0239、1.328±0.0359，由此可见HA-1/SR组和HA-2/SR组细胞增殖明显(P<0.05)，而纯SR组细胞的增殖受限(P<0.05)。通过各组OD值计算所得的相对增殖率(RGR)分别为100%、76.39%、138.86％、131.91％，根据RGR判断出HA-1/SR和HA-2/SR涂层材料毒性等级为0级，而纯SR的毒性等级为1级。
　　 5.Hoechst33342和PI双染法检测发现，与凋亡组比较，纯SR组、HA-1/SR组和HA-2/SR组表面生长的细胞均未对PI着色，且在Hoechst33342染色后，细胞核呈现正常的形状和颜色，未发生凋亡或坏死。
　　 6.Real-time PCR检测结果显示：与正常组相比，HA-1/SR组和HA-2/SR组的细胞中vinculin mRNA、OPN mRNA表达明显增高(P<0.05)，而HA-1/SR组与HA-2/SR组比较，vinculin mRNA和OPN mRNA表达增高(P<0.05)，纯SR组细胞中vinculinmRNA、OPN mRNA的表达均有所降低(P<0.05)。实验结果表明HA/SR涂层材料更利于细胞粘附作用。
　　 7.Western blot检测结果显示：与正常组比较，HA-1/SR组和HA-2/SR组细胞中vinculin蛋白和OPN蛋白的表达水平明显增高(P<0.05)，HA-1/SR组与HA-2/SR组比较，vinculin蛋白和OPN蛋白表达增高(P<0.05)，而纯SR组细胞中vinculin蛋白和OPN蛋白的表达则明显低于正常组细胞(P<0.05)。
　　 结论
　　 1.HA/SR涂层材料制作方法简单，便于生产和加工。
　　 2.HA-1/SR和HA-2/SR在力学性能和理化性能等方面符合国家医用软组织填充材料的使用要求。
　　 3.在体外试验中，HA-1/SR和HA-2/SR涂层材料与纯SR相比，明显改善了材料表面的细胞粘附性及生物活性，所以涂层材料更适合应用于人体，并且HA-1/SR更优于HA-2/SR。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 HA/SR涂层材料的制备及形貌观察

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 HA/SR涂层材料的理化性质研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 HA/SR涂层材料的生物相容性研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 组织发育和构建及其调节机制

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章