免疫细胞迁移试验评价生物材料免疫原性的探索性研究

摘要

在大面积烧伤患者的皮肤移植过程中所需的自体皮源十分有限，而异体或异种皮移植又存在排异反应。异基因组织工程皮肤因其具有来源广泛，促进再生等特点在烧伤治疗中有良好的临床应用前景，已成为近年来创面修复研究的热点之一。然而如何克服免疫排斥反应是异基因组织器官移植面临的重大挑战。组织工程医疗产品的安全性问题一直受到国内外食品药品监督局及卫生管理机构的重视，尤其是其产品用于人体之前的生物学评价。因此，从多个角度客观评价其产品的免疫原性是医用生物材料研发的重大需求。本课题就从细胞迁移的角度分析评价组织工程医疗产品的免疫原性。通过检测细胞趋化活性，探索一种评价生物材料的免疫原性的实验方法，为评价研发的新型组织工程皮肤材料的免疫原性提供新方法及理论依据。
　　 目的
　　 1.通过兔血淋巴细胞的迁移试验，检测刺激剂对淋巴细胞的剂量效应，初步建立一种兔淋巴细胞迁移试验评价生物材料免疫原性的实验方法。
　　 2.再次通过检测小鼠脾脏淋巴细胞的迁移，并初步建立由细胞迁移试验评价材料免疫原性的实验方法；
　　 3.基于本实验室前期探索的朗格汉斯细胞体外诱导方案，采用扫描电镜和透射电镜观察朗格汉斯细胞形态及CD196和CD86的表型鉴定，筛选出朗格汉斯细胞体外诱导培养的最佳方案，预期为探索朗格汉斯细胞迁移试验提供效应细胞。
　　 方法
　　 1.不同刺激剂作用下的兔淋巴细胞迁移试验
　　 1.1取新西兰大耳白兔(雌雄不限)静脉血，采用密度梯度离心法分离出淋巴细胞，用PHA和ConA分别作为淋巴细胞分泌趋化因子的刺激剂。在细胞悬液中，加入不同浓度的刺激剂，置37℃含5%CO2的孵箱中生长培养72小时，收集细胞上清。
　　 1.2将细胞上清作为趋化因子的来源，诱导兔淋巴细胞迁移，用Transwell法测定其细胞迁移率，比较各种刺激剂的迁移效果，了解不同刺激剂的淋巴细胞迁移效应。
　　 2.不同刺激剂作用下的小鼠淋巴细胞迁移试验
　　 2.1.取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾脏，采用研磨法分离淋巴细胞，分别用PHA、ConA和CD3ε单克隆抗体作为淋巴细胞分泌趋化因子的刺激剂。在细胞悬液中，加入不同浓度刺激剂，置37℃含5%CO2的孵箱中生长培养72小时，收集细胞上清。
　　 2.2将细胞上清作为趋化因子的来源，诱导小鼠淋巴细胞迁移，用Transwell法测定其细胞迁移率，比较各种刺激剂的迁移效果。了解其刺激剂的淋巴细胞迁移效应。
　　 3.不同生物材料浸提液作用下的小鼠淋巴细胞迁移试验
　　 3.1制备生物材料浸提液：(1)可溶性材料，选取牛Ⅰ型胶原，将之溶解于纯度>99.5%的乙酸溶液，小量分装，保存于4℃。(2)不溶性材料，选取脱细胞冻干牛真皮，将其称量后，按比例浸泡于RPMI-1640，孵育24小时，收集其浸提液，小量分装保存于-20℃。
　　 3.2取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾脏，采用研磨法分离淋巴细胞，分别用生物材料浸提液作为淋巴细胞分泌趋化因子的刺激剂。在细胞悬液中，加入不同浓度材料浸提液，置37℃含5%CO2的孵箱中生长培养72小时，收集细胞上清。
　　 3.3将细胞上清作为趋化因子的来源，诱导小鼠淋巴细胞迁移，用Transwell法测定细胞迁移率，比较各种材料浸提液的迁移效果。了解其材料的淋巴细胞迁移效应。
　　 4.小鼠淋巴细胞上清中趋化因子浓度水平的测定
　　 4.1取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾脏，采用研磨法分离淋巴细胞，分别用PHA、ConA和CD3ε单克隆抗体作为淋巴细胞分泌趋化因子的刺激剂。在细胞悬液中，加入不同浓度刺激剂，置37℃含5%CO2的孵箱中生长培养72小时，收集细胞上清。
　　 4.2酶联免疫吸附测定(ELISA)：在酶标仪上检测刺激剂作用小鼠淋巴细胞后的细胞上清中趋化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3、IL-16、IL-8及CCL20对应的OD450值，计算出各趋化因子的浓度水平。
　　 5.朗格汉斯细胞的体外诱导实验
　　 5.1先用人淋巴细胞分离液得到脐血单个核细胞，以CD34直接免疫磁珠法对脐血单个核细胞进行直接标记，分选和纯化脐血单个核细胞中的CD34+细胞。
　　 5.2以5种不同的细胞因子组合诱导方案，对分选出的CD34+细胞进行体外诱导培养，通过扫描电镜和透射电镜观察其细胞生长形态。
　　 5.3结合本实验室已有的表型鉴定的数据，再用流式细胞仪对其进行CD196及CD86表型鉴定，筛选出最佳的LC体外诱导方案。
　　 结果
　　 1.兔淋巴细胞迁移试验中，PHA和ConA对应的细胞迁移率，均和阴性对照有显著差异。其中，PHA组的刺激浓度为5μg/ml时，其对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组；ConA组的刺激浓度为5、10μg/ml时，其对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组。
　　 2.小鼠淋巴细胞迁移试验中，PHA组对应的细胞迁移率和对照组无明显差异；ConA和CD38对应的细胞迁移率，均和阴性对照有显著差异。其中，ConA组的刺激浓度为20μg/ml时，其对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组；CD3ε组，其浓度分别为2.5和10μg/ml时，对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组。
　　 3.牛Ⅰ型胶原溶解液，其细胞迁移率和阴性对照有显著差异。其中，当浓度为5和10μg/ml时，对应的淋巴细胞迁移率和对照组有明显差异；当其浓度分别为100、200和300μg/ml时，对应的淋巴细胞迁移率和对照组有非常显著的差异。
　　 4.脱细胞牛真皮浸提液，作用于淋巴细胞，其对应的四个浓度的细胞迁移率和对照组均无明显差异。
　　 5.在各个刺激剂组中，ELISA测得的多种趋化因子水平在总体上存在明显差异。趋化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3的水平明显高于对照，说明这几个因子在淋巴细胞迁移中起到重要的作用。趋化因子IL-16、IL-8及CCL20的水平和对照无明显差异。
　　 6.通过扫描电镜和透射电镜的结果，结合已有的表型鉴定的数据，可知方案Ⅳ为最佳方案。
　　 结论
　　 1.兔淋巴细胞迁移试验中，PHA和ConA均能诱导淋巴细胞迁移，其迁移率和对照组有显著差异。
　　 2.小鼠淋巴细胞迁移试验中，PHA对淋巴细胞迁移无增强作用；ConA和CD3ε均能诱导淋巴细胞迁移，其迁移率和对照组有显著差异。
　　 3.PHA、ConA及CD3ε均诱导淋巴细胞分泌不同浓度水平的趋化因子。
　　 4.牛Ⅰ型胶原溶解液对小鼠淋巴细胞迁移有增强作用，脱细胞牛真皮浸提液对小鼠淋巴细胞迁移无增强作用。
　　 5.通过扫描电镜及透射电镜观察朗格汉斯细胞的超微结构，结合前期的表型鉴定结果，可知Ⅳ方案为最佳诱导方案。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词索引

前 言

参考文献

第一部分 兔血淋巴细胞迁移试验评价刺激剂免疫原性的实验研究

材料和方法

结 果

讨 论

第一部分 照片

参考文献

第二部分 BALB/c小鼠淋巴细胞迁移试验评价刺激剂及生物材料免疫原性的实验研究

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 脐血朗格汉斯细胞体外诱导方案的探索实验

材料和方法

结 果

讨 论

第三部分 照片

参考文献

全文结论

致谢

文献综述 T细胞相关趋化因子及受体的研究进展

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

攻读硕士学位期间申请专利