大鼠内嗅皮层微注射Orexin-A对睡眠—觉醒及空间记忆的影响

摘要

1998年发现的Orexin是一类小分子神经肽，也称hypocretin(hypocretin-1和hypocretin-2)，由外侧下丘脑Orexin神经元产生，有两个单体：Orexin-A和Orexin-B。它们是来自同一基因转录产物。Orexin-A由33个氨基酸构成，其中有四个半胱氨酸形成链内的二硫键。Orexin系统主要通过Orexin-1(OXIR)受体和Orexin-2(OX2R)受体发挥作用，两受体均为G-蛋白偶联受体，OX1R和Orexin-A的亲和力高于Orexin-B，而OX2R与Orexin-A和Orexin-B亲和力相同。Orexin神经元的投射几乎遍布大脑的各个脑区，在维持觉醒中具有重要的意义，并且基因敲除小鼠或其受体基因突变可引起发作性睡眠病[1]。同时，研究发现Orexin神经元可以投射到海马(Hp)，与空间学习记忆密切相关[2-4]。
　　 内嗅皮层(entorhinalcortex，EC)在海马和联合皮层的双向信息交流中起着接替站的作用。EC浅层主要神经元接受新皮层的输入，投射至海马。深层主要接受海马CA1和下托的输入，将其传回至新皮层。EC参与形成的海马-EC-新皮层环路在情景记忆的形成以及巩固中发挥重要的作用[5]。EC可分为外侧内嗅皮层(LEC)和内侧内嗅皮层(MEC)。目前认为MEC主要参与传递和处理空间信息，在空间认知功能中具有重要的意义[6-9]。
　　 本研究采用多导睡眠记录和微注射技术，首先观察内嗅皮层内，外源性的OrexinA对大鼠睡眠.觉醒周期时间的影响，然后采用T-迷宫交替选择模式初步观察内嗅皮层OrexinA对大鼠空间记忆的影响，之后采用旷场实验观察微注射OrexinA对大鼠运动功能及探索行为的影响。结果如下：
　　 1.Orexin受体在EC中的表达及在浅层中与reelin和calbindin的共表达
　　 对成年大鼠EC脑片进行OX1R和OX2R免疫荧光化学检测，观察Orexin受体在EC中正常表达和在浅层中与reelin和calbindin的共表达情况。结果显示：浅层中OX1R的表达较深层要高得多，OX2R在EC中的表达模式与OX1R类似；OX1R在reelin阳性细胞和calbindin阳性细胞中均有表达，表明OX1R可能广泛表达于EC浅层的主要神经元中。同时考虑到EC的reelin和calbindin信号在空间学习记忆中的重要作用，这也暗示了Orexin受体在空间学习记忆中的重要作用。
　　 2.OrexinA对睡眠-觉醒周期的影响
　　 在内嗅皮层脑区微注射不同剂量OrexinA，观察大鼠睡眠.觉醒的变化。与ACSF自身对照相比，分别给大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射不同浓度的0.04nmol，0.06nmol，0.1nmol OrexinA后3小时11:00～12:00、12:00～13:00、13:00～14:00觉醒周期时间无影响(P>0.05)，给药后24 h觉醒周期时间也无显著差异(P>0.05)。及在11:00～14:003小时内对觉醒时间无影响(P>0.05)，在11:00～14:003 h内NREM时间无影响(P>0.05)，在11:00～14:003小时后REM也无影响(P>0.05)，即对3h内(11:00～14:00)大鼠总睡.眠觉醒时间无显著性差异(P>0.05)。结果显示大鼠内嗅皮层微注射OrexinA对它的睡眠，觉醒周期无影响。
　　 3.OrexinA受体阻断剂SB-334867对睡眠-觉醒周期的影响
　　 在内嗅皮层脑区微注射Orexin A受体阻断剂SB-334867，观察睡眠-觉醒周期变化。与DMSO自身对照相比，给大鼠内侧内嗅皮层双侧微注射SB-334867(0.1nmol，5μl)后3小时11:00～12:00、12:00～13:00、13:00～14:00觉醒周期时间无影响(P>0.05)，给药后24 h觉醒周期时间也无显著差异(P>0.05)。及在11:00～14:003小时内对觉醒时间无影响(P>0.05)，在11:00～14:003 h内NREM时间无影响(P>0.05)，在11:00～14:003小时后REM也无影响(P>0.05)，即对3 h内(11:00～14:00)大鼠总睡-眠觉醒时间无显著性差异(P>0.05)。表明大鼠内嗅皮层微注射SB-334867对睡眠.觉醒周期无影响。
　　 4.EC脑区OrexinA对空间记忆的影响
　　 1)OrexinA受体阻断剂SB-334867对空间记忆的影响
　　 在内嗅皮层脑区微注射，分别按两种T-迷宫模式(保持模式，获得模式)，观察对空间记忆的影响。连续训练大鼠，在内侧内嗅皮层区微注射，对大鼠DMSO组间对照和OrexinA受体阻断剂SB-334867给药后的T-迷宫选择正确次数进行统计。给大鼠内嗅皮层双侧微注射SB-334867(6mM，0.5μl)，T-迷宫交替选择正确次数明显减少，正确率下降78%，有显著性差异(p<0.05)。提示SB-334867影响了空间记忆，降低了空间记忆功能。即内嗅皮层内源性OrexinA促进了空间记忆功能。
　　 2)敲低Orexin A受体表达(RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP)对大鼠空间记忆的影响
　　 大鼠内嗅皮层微注射手术，在内嗅皮层脑区微注射空白对照组SCR(RAAV2/1-SCR-shRNA-EGFP)及干扰组OR1(RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP)，观察内嗅皮层敲低Orexin A受体表达后对大鼠空间记忆的影响。以SCR对照在内嗅皮层微注射OR1干扰病毒，分两组，对大鼠SCR组间对照组和OR1干扰组分别21天后开始T-迷宫训练，训练持续21天。对其结果进行统计，交替选择正确次数减少，正确率下降48%，有显著性差异(p<0.05)。提示，敲低Orexin A受体表达，降低了空间记忆功能。即内嗅皮层OrexinA受体参与了且提高了空间记忆能力。
　　 5.术后内嗅皮层微注射药物对大鼠探索行为及运动功能的影响
　　 大鼠内嗅皮层套管埋置手术恢复后，在内嗅皮层脑区微注射对照ACSF，DMSO以及药物组Orexin A及其受体阻断剂SB-334867，观察对探索行为和运动功能的影响。在内嗅皮层分别微注射药物(ACSF，DMSO，orexin A，SB-334867)分四组，对大鼠ACSF，DMSO组间对照和OrexinA及受体阻断剂SB-334867给药15min后在旷场中的站立次数和所走的格子数进行统计。给大鼠内嗅皮层微注射(0.1nmol，0.5μl)Orexin A，大鼠的站立次数和行走的格子数无明显变化，无显著性差异(P>0.05)；微注射(6mM，0.5μl)Orexin A受体阻断剂SB-334867，大鼠站立次数和行走的格子数无明显变化，无显著差异(P>0.05)。表明术后内嗅皮层微注射药物对大鼠探索行为及运动功能无影响。
　　 综上所述，本研究结果表明：一，EC区OR1在reelin阳性和calbindin阳性神经元中都有表达。二，EC微注射不同剂量OrexinA对大鼠的睡眠-觉醒周期无影响。三，EC微注射Orexin A受体阻断剂SB-334867对大鼠睡眠.觉醒周期无影响。四，EC脑区的orexinA信号对大鼠空间记忆功能有重要影响。五，术后微注射药物对大鼠的探索行为和运动功能无影响。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 大鼠内嗅皮层微注射Orexin-A对睡眠-觉醒的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 大鼠内嗅皮层微注射Orexin-A对空间-记忆的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

致谢

文献综述 Orexin及其受体的主要生理功能及相关机制

参考文献

在读硕士期间发表的论文