嗅鞘细胞移植延缓RCS大鼠视网膜色素变性进程的研究

摘要

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组以感光细胞或视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium)功能异常为表现的遗传性致盲性眼病，目前临床上尚无有效的方法来阻止或逆转其退行性改变。近年来对视网膜色素变性疾病的临床及基础研究取得一定进展，细胞移植作为视网膜变性疾病的再生性疗法为治疗开劈了新的途径。然而，诸如干细胞、色素上皮细胞等成体细胞移植，因存在供体细胞来源、免疫排斥、伦理等多种问题限制了其进一步的研究和应用。
　　 在RP过程中，发生了一系列复杂的形态和功能变化。原发于RPE吞噬功能障碍的RP，由于脱落的盘膜堆积在视网膜下腔，导致光感受器细胞外节代谢异常，从而引发光感受器细胞死亡，并累及内核层，继而引起大范围视网膜神经元的凋亡、坏死及突触重构4。Müller细胞在正常视网膜中具有参与视网膜糖代谢、调节视网膜血流、参与神经递质循环、调节视网膜水电解质平衡、参与感光色素循环过程及控制神经元兴奋性等功能。在视网膜色素变性早期，Müller细胞活化、增殖，向外迁徙并在视网膜下间隙形成胶质瘢痕，使残存的视网膜无法从色素细胞和脉络膜获得营养因子和生存支持，光感受器细胞和神经元逐渐死亡，完全阻断了感光细胞外节的再生。同时，Müller细胞在增殖过程中表达了一系列表面抑制分子，抑制了正常的组织修复和神经再生3，20
　　 RP的神经元丢失和胶质增生与中枢神经系统(central nervous system，CNS)损伤的病理过程非常相似。CNS受损后，以星形胶质细胞为主的胶质细胞在受损部位形成胶质瘢痕，阻碍了神经轴突的再生。近年来嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植治疗神经损伤和神经系统退行性病变疾病是医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点5。有研究认为OECs的修复作用是在嗅成纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts，ONFs)的协同作用下实现的14。移植的OECs打破胶质瘢痕的阻挡，引导再生的轴突进入CNS，从而与靶器官形成新的功能连接。OECs是目前唯一一种在成熟阶段还有生长能力的特殊类型的神经胶质细胞，广泛分布于嗅黏膜、嗅神经和嗅球的表面两层(嗅神经纤维层和嗅小球层)6-8，具有可自体移植的优势，是细胞移植修复中枢神经系统损伤中很有希望的种子细胞之一9-13。
　　 近年来OECs在视网膜疾病和视神经创伤治疗方面的应用已有报道15-19。其可以包绕视网膜节细胞(retinal ganglion cell，RGC)的轴突，延缓受损的RGC的坏死，并促进视神经轴突的再生。然而目前OECs在RP治疗方面的应用还未见报道。
　　 综合上述的研究背景以及我实验室的前期研究结果，我们提出假设：嗅鞘细胞移植抑制Müller细胞所形成的胶质瘢痕，保护视网膜神经元，从而延缓RP的视网膜退行性变进程。
　　 针对以上假设，本研究采用OECs/ONFs混合细胞(由于ONFs只是OECs的支持成分，所以以下简称OECs)在体移植技术，利用经典视网膜色素变性模型RCS大鼠，对比嗅鞘细胞移植后移植组、伪手术组和对照组视网膜的结构和功能变化。并初步探讨了OECs的作用机制。主要内容及研究结果如下：
　　 1、嗅鞘细胞离体和在体的生物学特性研究。通过原代培养法获得大量的嗅鞘细胞和嗅球成纤维细胞的混合细胞，经巩膜外路法移植入30天龄的RCS-P+大鼠视网膜下腔。结果显示，移植后OECs呈多样化的伸展形态，在移植后1周、3-4周和6-8周三个时间点，移植细胞大量存活，细胞总数在移植后3-4周数量最多，6-8周时数量下降。移植细胞在视网膜下腔移植点向周围逐渐迁移，并向视网膜内层迁移。而在术后4周和8周两个时间点，同样方法移植入正常大鼠视网膜下腔的OECs未见明显迁移。结果提示：OECs可在变性的视网膜环境中生存和迁移，其迁移能力与视网膜环境密切相关。
　　 2、将表达绿色荧光蛋白的QECs移植入RCS大鼠视网膜下腔，于移植后4周、8周、12周三个时间点观察视网膜的形态和功能变化。结果显示，OECs移植组Müller细胞的增殖被抑制，其在视网膜下腔形成胶质瘢痕的面积减少，Western blot蛋白定量提示，其增殖相关蛋白GFAP表达的水平较伪手术组相比有显著下降；视网膜感光神经元的凋亡被抑制，神经元的数量显著高于伪手术组和对照组，且感光细胞的形态优于伪手术组和对照组；闪光视网膜电图(FERG)评测RCS-P+大鼠视功能改善情况，发现OECs移植后视网膜的电生理功能显著改善。结果提示：OECs可以抑制变性视网膜Müller细胞的异常活化，减少视网膜神经元的凋亡，保护视网膜感光细胞，改善视网膜功能，从而延缓了视网膜色素变性的进程。
　　 3、嗅鞘细胞缓解视网膜色素变性进程的机制研究。体外培养嗅鞘细胞，收集培养11-14天培养液上清，行ELISA检测bFGF、BDNF和NGF表达量。结果显示，嗅鞘细胞可以分泌bFGF、BDNF和NGF等多种神经营养因子，这些神经营养因子的分泌将有助于视网膜神经元的存活和生长。体外实验比较嗅鞘细胞和视网膜色素上皮细胞对FITC标记的猪感光细胞外节的吞噬能力，并对可能的吞噬相关蛋白进行定性及定量研究。结果显示，嗅鞘细胞与视网膜色素上皮细胞相比，具有更强的吞噬能力。可防止视网膜色素上皮功能障碍造成的外节盘膜堆积对感光细胞正常功能的影响。其对POS的吞噬过程是由受体介导的特异性吞噬，包括由integrinαvβ5、TLR4、CD36介导的识别结合，以及经pFAK活化的Mertk介导的吞噬以及cathepsinD对POS的消化过程。结果提示：OECs对视网膜退变的延缓是通过多种途径作用产生的，对其相关机制的探索为OECs在视网膜疾病治疗领域的应用奠定了基础。
　　 结论：
　　 1、本研究首次将OECs移植应用于视网膜色素变性的治疗研究，发现OECs在变性的视网膜环境下可以大量存活和迁移，为自体移植的临床应用奠定了基础；
　　 2、OECs移植后抑制了Müller细胞的异常增殖，促进了视网膜内营养环境的修复，减少了视网膜神经元的凋亡，有效地延缓了视网膜色素变性的进程；
　　 3、OECs移植后视网膜功能状态的改变对视功能的重建具有重要意义；
　　 4、OECs分泌多种神经营养因子，可以更广泛的营养支持视网膜神经元；
　　 5、OECs对感光神经元外节的特异性吞噬作用代偿了由于RPE功能异常所导致的视网膜代谢障碍，在视网膜色素变性治疗领域具有广阔的发展前景。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 嗅鞘细胞离体和在体的生物学特性研究

前 言

第一节 大鼠嗅鞘细胞的培养和鉴定

材料和方法

结 果

第二节 嗅鞘细胞的荧光标记

材料和方法

结 果

第三节 嗅鞘细胞视网膜下腔移植后生物学特性研究

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 嗅鞘细胞移植延缓RCS大鼠视网膜变性进程的研究

前 言

第一节 嗅鞘细胞移植对RCS大鼠视网膜Muller细胞的影响

材料和方法

结 果

第二节 嗅鞘细胞移植对RCS大鼠视网膜感光细胞的影响

材料和方法

结 果

第三节 嗅鞘细胞移植对RCS大鼠视网膜功能的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 嗅鞘细胞延缓RCS大鼠视网膜色素变性的机制研究

前 言

第一节 嗅鞘细胞分泌促神经生长因子的定量检测

材料和方法

结 果

第二节 嗅鞘细胞吞噬功能检测

材料与方法

结 果

第三节 嗅鞘细胞吞噬功能的信号通路研究

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 嗅鞘细胞的特性及应用前景

参考文献

研究生期间发表文章

英文论著