Golgi体在外周血单核细胞TLR4超敏中的作用及NPY抑制效应

摘要

目的：
　　 临床观察发现，严重创伤病人脓毒血症发生率明显增加。一些研究认为，创伤后组织、细胞破碎产物能够初步激活免疫系统，如果此时再发生病原微生物入侵，其结果是炎症因子过度释放，并提出TLR4超敏的概念。已有研究发现，炎症细胞Golgi体内存在大量TLR4，但其在脓毒症的发生发展过程中有何作用，是否参与了创伤后脓毒症过程中TLR4超敏反应，目前尚不清楚；既往已有资料证实神经肽Y可抑制炎症反应，它能否抑制致敏细胞过度释放炎症因子，尚待证实。为此，本课题拟以健康正常人免疫细胞PBMC为对象，通过建立PBMC TLR4的致敏细胞模型，旨在探索Golgi体在TLR4超敏中的作用及神经肽Y对超敏细胞释放炎症因子的影响，以期深入了解TLR4致敏的机制，同时为治疗创伤后过度炎症反应提供新的途径。
　　 方法：
　　 1.梯度离心法从浓缩人外周血白细胞中分离出PBMC，以1×106/ml接种于24孔细胞培养板，实验设立空白对照组、Fn组、LPS组、Fn+LPS复合组，以5ug/ml Fn或(和)1ug/mlLPS刺激PBMC0.5、2、4、8、12h后收集细胞培养上清，酶联免疫法(ELISA)检测其炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10水平；Western blot法检测各处理组TLR4的表达量。
　　 2.PBMC分离培养同前，设立空白对照组、Fn组、NPY+Fn组、LPS组、NPY+LPS组、Fn+LPS组和NPY+Fn+LPS组，先以NPY5ug/ml预处理PBMC2h，再加入5ug/ml Fn或(和)1ug/ml LPS继续刺激细胞0.5、2、4、8、12h，检测各组细胞培养上清IL-6、TNF-α和IL-10水平和细胞TLR4的表达量。
　　 3.设立Fn组、BFA+Fn组、Fn+LPS组和BFA+Fn+LPS组，用布雷菲德菌素A(brefeldinA，BFA)5ug/ml预处理PBMC3h，去除含BFA的培养基并洗涤细胞3次，再以5ug/ml Fn或(和)1ug/ml LPS处理PBMC0.5、2、4、8、12h，检测各组细胞培养上清IL-6、TNF-α和IL-10水平和细胞TLR4的表达量。
　　 结果：
　　 1.Fn对LPS刺激PBMC合成和释放炎症因子的影响
　　 (1)IL-6：空白对照组各时相点IL-6均处于低水平表达，不同时相点比较无统计学差异(p>0.05)；处理0.5h后，Fn组、LPS组和Fn+LPS组IL-6释放量未见明显增加(p>0.05)；处理2h后，Fn+LPS组较之Fn组和LPS组，IL-6释放水平增加明显(p<0.05)；处理8h后，Fn+LPS组IL-6达释放峰值，与空白对照组、Fn组及LPS组比较，差异非常显著(p<0.05)：
　　 (2)TNF-α：处理0.5h后，各组之间TNF-α产生水平未见显著差异(p>0.05)；与空白对照组、Fn组及LPS组比较，Fn+LPS组在处理2h、4h、8h、12h后，TNF-α均有所增加(p<0.05)。
　　 (3)IL-10：与空白对照组、Fn组及LPS组比较，Fn+LPS组在处理0.5h、2h后，IL-10释放量均无明显增加(p>0.05)；处理4h后，Fn+LPS组较之Fn组和LPS组，IL-10释放水平增加明显(p<0.05)，其增加趋势也出现在8h和12h。
　　 (4)TLR4：与LPS组比较，Fn+LPS组在处理0.5h后，TLR4表达量无明显增加(p>0.05)；处理2h、4h后，Fn+LPS组TLR4表达量明显增加，与同时相点其它3组比较差异显著(p<0.05)。
　　 2.NPY对Fn增敏LPS刺激PBMC释放炎症因子作用的影响
　　 (1)IL-6：处理0.5h后，NPY+Fn组较之Fn组IL-6释放量无明显减少(p>0.05)；与LPS组比较，各时相点NPY+LPS组IL-6释放量无明显减少(p>0.05)；处理2h后，NPY+Fn组和NPY+Fn+LPS组IL-6释放量分别低于Fn组和Fn+LPS组(p<0.05)，这种抑制作用也出现在4h和8h。
　　 (2)TNF-α：处理PBMC2h、4h后，NPY+Fn组较之Fn组，NPY+Fn+LPS组较之Fn+LPS组，TNF-α的释放量明显减少(p<0.05)，但高于同时间空白对照组和Fn组；处理8h、12h后，NPY+Fn组较之Fn组，TNF-α释放量未见显著减少(p>0.05)。
　　 (3)IL-10：与Fn组比较，NPY+Fn组在处理0.5h、2h后，IL-10释放量无显著减少(p>0.05)；处理4h、8h后，NPY+Fn组较之Fn组，NPY+Fn+LPS组较之Fn+LPS组，IL-10释放量显著减少(p<0.05)。
　　 (4)TLR4：与Fn组比较，NPY+Fn组在处理0.5h后，TLR4表达量未见明显减少(p>0.05)；处理2h和4h后，NPY+Fn组较之Fn组，NPY+Fn+LPS组较之Fn+LPS组，TLR4表达量显著降低(p<0.05)。
　　 3.BFA干扰Golgi体蛋白转运后对炎症因子合成和释放的影响
　　 (1)处理PBMC0.5h、2h、4h后，BFA+Fn组较之Fn组，BFA+Fn+LPS组较之Fn+LPS组，IL-6、TNF-α、IL-10释放量均明显减少(p<0.05)。
　　 (2)TLR4：与Fn组比较，BFA+Fn组在处理0.5h、2h、4h后，TLR4表达量显著降低(p<0.05)；与Fn+LPS组比较，BFA+Fn+LPS组在处理0.5h、2h后，TRLA表达量显著降低(p<0.05)。
　　 结论：
　　 1.Fn单独处理PBMC可以导致炎症因子释放增加，Fn复合LPS刺激，炎症因子进一步释放，且TLR4也呈现相应的表达趋势，提示Fn能够增加PBMC TLR4对LPS的敏感性。
　　 2.NPY能够抑制Fn对PBMC的致敏作用，从而减少炎症因子的释放，可能的抑制机制是通过减少TLR4的表达实现。
　　 3.BFA抑制PBMC Golgi体蛋白转运作用，使Fn处理后TLR4表达和炎症因子释放均减少，Golgi体可能参与了TLR4的致敏过程。

目录

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材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 神经肽Y的作用及机制

参考文献

攻读硕士期间发表的论文及参加学术会议情况