新城疫病毒Italien株辅助质粒的构建和功能鉴定

摘要

采用溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)对肿瘤进行治疗的策略是目前肿瘤生物治疗领域的一个新的热点，目前已经有多种天然的以及人工的溶瘤病毒被用于肿瘤治疗研究中，并且通过对天然溶瘤病毒进行基因重组，获得更加安全有效地重组溶瘤病毒是目前研究的一个新方向。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一种天然溶瘤病毒，具有在人体肿瘤细胞中选择性复制的特性，而对人正常细胞没有明显的致病力。通过反向遗传学技术，可以构建携带外源基因的重组病毒。本研究以NDV的强毒株和溶瘤毒株Italien为研究对象，初步探讨了其体外的溶瘤特性，同时构建了基于噬菌体T7启动子的病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)，磷蛋白(phosphoprotein，P)以及L蛋白(large protein，L)的真核表达质粒以及病毒的微型基因组质粒，作为辅助质粒用于今后重组病毒的构建。通过本课题，对NDV Italien株的溶瘤特性有了初步的了解，并且为今后获得重组的新城疫病毒打下了坚实的基础。
　　 本研究的主要结果如下：
　　 1.检测NDV Italien感染肿瘤细胞后对其杀伤作用利用无特定病原种鸡胚(specific pathogen free，SPF)培养NDV Italien，3天后收集鸡胚尿囊液，浓缩纯化得到病毒悬液。采用TCID50(median tissue culture infective dose)法测定病毒悬液的滴度。NDV Italien感染人宫颈癌细胞HeLa细胞后在不同时间点通过苏木精，伊红染色观察细胞融合情况。用不同剂量的NDV Italien感染肿瘤细胞，测定其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示：NDV Italien经鸡胚培养和超速离心纯化浓缩后，获得了高滴度的NDV病毒悬液，达1010 TCID50/ml。苏木精-伊红染色显示，病毒感染肿瘤细胞引起了细胞与细胞之间广泛的融合，最终形成了大量多核细胞即细胞合胞体。MTT细胞毒性实验显示，病毒感染肿瘤细胞后细胞存活率显著下降，表明NDV Italien毒株对肿瘤细胞有很强的细胞杀伤能力。
　　 2.NDV Italien株辅助质粒的构建利用RNA提取试剂盒提取病毒的基因组RNA，并且通过高保真的RT-PCR方法获得病毒NP，P和L基因。同时，利用高保真PCR的方法，获得带有T7启动子，内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites，IRES)元件以及EGFP编码序列的片段并连入T载体，得到质粒T7-test。随后，利用酶切的方法将病毒NP，P和L基因分别替换T7-test中的EGFP，得到NP，P和L基因的真核表达质粒。最后，转染上述表达质粒至可以稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞中，利用间接免疫荧光检测细胞中病毒蛋白的表达情况。结果表明：经过鸡胚尿囊腔培养以及病毒纯化后，得到了高浓度的病毒悬液；利用RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA并且进行了RT-PCR，获得了病毒NP、P和L蛋白的编码基因；利用高保真PCR的方法成功得到了携带有T7，IRES以及EGFP的质粒T7-test，将该质粒转染BSR-T7/5细胞后可以观察到EGFP的表达，证实该质粒可以利用T7RNA聚合酶在真核细胞中高效表达下游基因；最后，利用酶切的方法将病毒NP，P和L基因分别替换EGFP，得到了上述基因的真核表达质粒，分别命名为T7-NP，T7-P和T7-L，将上述质粒转染BSR-T7/5细胞后，可以表达病毒蛋白。
　　 3.病毒微型基因组质粒的构建以及辅助质粒功能验证合成丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus，HDV)的自身催化核酶序列(HDVrz)，利用RT-PCR的方法由NDV基因组RNA中扩增3’和5’端的非编码序列，通过overlap PCR的方法将T7启动子，NDV基因组非编码序列，报告基因依次连接，随后通过酶切/连接方式插入包含HDVrz序列质粒得到病毒的微型基因组质粒。利用NDV感染事先转染有微型基因组质粒的BSR-T7/5细胞，通过观察报告基因的表达，验证微型基因组的功能。最后，微型基因组与辅助质粒共转染细胞后通过观察报告基因的表达以了解辅助质粒的功能。结果显示：HDV的自身催化核酶通过人工合成后插入到pUC-57质粒中得到重组质粒pUC-HDVrz，同时在其上游加入酶切位点。利用RT-PCR的方法由病毒基因组RNA中扩增其3’和5’完整的非编码去序列，通过overlap PCR的方法成功地与萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)基因进行连接，并且在片段上游添加了T7启动子序列。将所得到的微型基因组片段通过酶切/连接方法连入pUC-HDVrz中，得到了病毒的微型基因组质粒，命名为MG-L。将该质粒转染BSR-T7/5细胞后，再用NDV感染，可以检测到报告基因的表达，证实该微型基因组具有利用病毒蛋白转录报告基因的功能。随后MG-L与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，在转染后36小时后检测到荧光素酶的表达，证实辅助质粒表达产物可以形成有功能的RNP复合物转录微型基因组中的报告基因。
　　 综上所述，本研究证实了溶瘤病毒NDV具有良好的体外杀伤肿瘤细胞的特性，同时成功地构建了可以用于溶瘤病毒NDV重组构建的辅助质粒，所构建的辅助质粒首次利用高效的噬菌体T7启动子与IRES序列结合，可以在特定真核细胞中表达病毒蛋白；同时成功构建了携带报告基因的病毒微型基因组质粒，并且利用所构建的病毒微型基因组质粒，验证了该类辅助质粒表达产物的完整功能，为今后利用辅助质粒进行重组病毒的复活打下了坚实的基础。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词一览表

前 言

第一部分 新城疫病毒Italien株对肿瘤细胞的杀伤作用

1 材料与方法

2 方法

3 结 果

4 讨论

第二部分 新城疫病毒辅助质粒的构建

1 材料与方法

2 方法与步骤

3 实验结果

4 讨 论

第三部分 病毒微型基因组质粒的构建以及辅助质粒功能验证

1 材料与方法

2 方法与步骤

3 实验结果

4 讨 论

全文小结

致谢

参考文献

文献综述 溶瘤病毒的构建及其应用研究进展

参考文献

攻读硕士学位期间发表文章目录