新生小牛与成人皮肤组织学及生物力学性能的比较和牛脱细胞真皮基质的制备

摘要

大面积烧伤、创伤患者救治的关键是如何及时有效的封闭创面。真皮成分的缺乏成为皮肤移植术后患者植皮区愈后外观及功能的主要影响因素，因此真皮移植和/或真皮替代物的研究成为改善烧伤、创伤和整形患者的预后，提高其生活质量的关键之一。由细胞外基质(ECM)组成的生物支架材料已经应用于各种外科重建并作为一种再生医学策略广泛应用于组织和器官替代。细胞外基质成分生物支架材料的来源有多种动物，由于细胞外基质成分生物支架有特殊的机械性能、保留了生物活性可促进组织再生，所以这些蛋白为基础的材料与人工合成材料在外科和再生医学的应用中有许多天然的优势。由于异体真皮的来源及其有限且价格昂贵，因此有必要选择一种与人真皮相对接近的异种真皮来源。在本课题组前期工作的基础上，我们选择了新生小牛皮肤，探讨与人皮肤组织结构、主要组成成分及其比例上的差异及生物力学性能特点，为临床应用牛真皮基质提供实验依据。并且对制备新生小牛脱细胞真皮基质的方法进行了探索，利用渗透冲击联合超声和去污剂处理的方法制备出了较为理想的异种脱细胞真皮基质，对所制备的脱细胞真皮基质的组织学和生物活性成分与天然真皮基质进行了对比。
　　 目的
　　 1.通过新生小牛与成人皮肤组织在形态学和生物力学性能方面的对比研究，寻找二者之间的异同点，为临床应用牛真皮基质提供实验依据。
　　 2.探索新生小牛脱细胞真皮基质的制备方法，观察处理前后真皮基质的组织学和生物活性成分的变化。
　　 方法
　　 1.收集新生小牛和成人背部全层皮肤标本，采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、Gomori醛复红染色、扫描电镜和透射电镜的方法，显微照相后进行形态学观察和图像分析软件的测量并制备新生小牛和成人皮肤生物力学试件，采用力学生物材料试验机检测皮肤的力学性能。
　　 2.收集并制备新生小牛网状层真皮，分别采用酶学法、渗透冲击联合去污剂法及渗透冲击联合超声和去污剂法探索制备脱细胞真皮基质，对制备出的脱细胞真皮基质采用大体观察和HE染色确定较为理想的制备方法；
　　 3.对制备出的脱细胞真皮基质进行HE染色、DAPI染色和核酸电泳检测细胞成分残留情况；扫描电镜(SEM)观察胶原束结构和细胞成分；PicoGreen法、DMMB法和BCA法对脱细胞前后真皮基质的DNA、sGAG和蛋白质含量进行定量分析；ELISA法测定脱细胞前后真皮基质内TGF-β1、EGF、bFGF和KGF含量。
　　 结果
　　 1.新生小牛与人的皮肤比较，真皮和表皮的厚度均明显变薄，两者的比值显著减小；真皮内Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维分别较人真皮增多和减少，但真皮胶原纤维束的间隙率[(41.72±1.81)vs(40.66±1.40)，P=0.467]和胶原纤维束粗细[(11.28±0.18)vs(10.88±0.66)，P=0.368]均没有统计学差异；
　　 2.扫描电镜观察可见新生牛真皮胶原纤维束与人真皮胶原纤维束均较纤细，排列疏松，且有一定的孔隙分布；透射电镜显示新生牛真皮胶原原纤维横纹周期长度较人真皮长，但两者的胶原原纤维直径无显著差异。
　　 3.生物力学检测示新生牛皮肤最大应力(21.08±0.91)MPa和杨氏模量(82.12±1.23)MPa均要明显高于人皮肤的最大应力(12.76±1.60)MPa(P=0.001)和杨氏模量(48.63±5.50)MPa(P=0.001)，而最大应变却明显低于人真皮[(0.51±0.002)mm vs(0.75±0.028)mm(P=0.001)]。
　　 4.酶学法可以制备出脱细胞真皮，但对网状层真皮要求较高，要求网状层真皮厚薄均匀，并且对制作网状层真皮的部位有一定要求；渗透冲击联合去污剂法所制备的脱细胞真皮HE染色观察细胞核去除较彻底，但所使用去污剂对胶原有一定程度破坏，变现为胶原纤维束松散，部分呈团块状；渗透冲击联合超声去污剂处理制备的脱细胞真皮HE染色观察细胞核去除较为彻底，胶原纤维束排列疏松，未见胶原纤维束结构明显破坏，DAPI染色未见真皮内有DNA着色，扫描电镜结果显示胶原纤维束排列疏松，未发现细胞存留。
　　 5.成分定量分析证实DNA含量[(2516.1±324.2)ng/mg vs(249.5±53.8)ng/mg，P=0.000)，下降了90.1%，sGAG含量[(5.92±0.50)μg/mg vs(2.48±0.24)μg/mg，P=0.000]，含量保留约41.9%。与脱细胞前比较，含水量有所下降[(72.83+1.43)% vs(69.68+1.78)%，P<0.05]。细胞因子检测TGF-β1含量[(478.8±196.1)pg/g vs(180.3±111.0)pg/g，P=0.009]和EGF含量[(10.52±2.78)pg/g vs未能检测到EGF含量]均明显减少；而bFGF含量[(788.6±333.8)pg/g vs(364.8±294.8)pg/g，P=0.424]下降了53.7％，KGF含量[(0.033±0.00019)pg/g vs(0.033±0.00022)pg/g，P=0.433]变化不显著。
　　 结论
　　 1.新生牛皮肤虽然在表皮与真皮厚度、真皮胶原类型比例以及生物力学上与人皮肤有差异，但真皮的胶原纤维束三维结构两者之间存在较大相似性。
　　 2.反复渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮基质明显地清除了细胞及细胞碎片，较好地保留了真皮细胞外基质的三维结构和主要生物活性成分，为进一步改进脱细胞真皮的制备方法提供了重要实验依据。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词索引

前 言

参考文献

第一部分 新生小牛皮肤与人皮肤的形态学及生物力学特点的比较

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 异种脱细胞真皮基质的制备及生物活性成分的检测

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

全文总结

致谢

文献综述 组织和器官脱细胞的研究进展

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及申请的专利