2型猪链球菌89K致病岛进化途径分析

摘要

猪链球菌是引起人兽共患病的一类重要致病菌，共有35个血清型，其中2型猪链球菌(S.suis2)致病性最强。既往2型猪链球菌通常引起人的扁桃体炎、关节炎、败血症、脑膜炎等疾病，多呈散在发病，一般没有流行趋向。但我国1998年在江苏江阴、2005年在四川资阳分别出现了两次2型猪链球菌病大流行，且表现出了罕见的“链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome，STSS)，该病发病急骤，来势凶险，病死率高。
　　 研究表明，导致我国江苏、四川大流行的菌株为高致病性强毒株。在对我国新出现的高致病性强毒株(S.suis98HAH12，S.suis05ZYH33)与欧洲参考株S.suis P1/7进行比较基因组学及核苷酸组成分析时鉴定出了“89K致病岛”(一段长约89 kb的基因组序列)。
　　 致病岛是一类特定的基因组岛，一般而言，细菌基因组岛是指细菌染色体上一段特定的DNA大片段，该片段在G+C含量、密码子使用偏嗜性、蛋白质的氨基酸频率等方面与细菌全基因组存在差异，且基因组岛往往携带有水平转移、致病、耐药、代谢途径等相关基因，使得这一段DNA片段往往成为一段具有特定功能的元件，且由于其水平转移的特性，使得其可以在细菌之间致病、耐药因子广泛传播的载体。
　　 目前，关于基因组岛的研究主要集中在一下一些方面：(1)基因组岛的鉴定与结构特征分析；(2)基因组岛对宿主菌造成的功能改变，如致病、耐药、耐重金属离子；(3)基因组岛的水平转移机制；长期以来，基因组岛的起源与进化历程是人们感兴趣的方向，但由于进化历程的复杂性，例如基因的重组，插入，丢失事件的发生，造成基因组岛不断变异，以及基因组岛的进化是一个长期的过程，观察其形成过程极为困难，使得基因组岛的来源问题扑朔迷离。然而，随公共数据库中细菌基因组序列的日益丰富，基因组岛的同源序列不断被人们发现，从而为推测基因组岛的整合过程提供了丰富的数据资料。例如，在对鲍曼不动杆菌耐药基因组岛AbaRl的研究中，发现该基因组岛的不同区域，其同源序列分布在不同属的细菌；在对铜绿假单胞菌基因组岛PAIP-1的研究中也发现了该基因组岛存在明显的嵌合结构特征，体现出模块化的特征。
　　 为了推测89K致病岛的进化历程，本研究主要利用了生物信息学的技术方法，对89K致病岛的同源序列分布，基因簇功能特点，89K致病岛碱基组成特征，主要研究内容包括：
　　 (1)89K致病岛的同源序列分析。将89K致病岛全序列提交NCBI数
　　 据库进行BLASTn比对，初步获得其同源序列的大致分布范围；再将89K致病岛的80个ORF分别提交蛋白质数据库，进行BLASTp比对，获取89K致病岛在不同菌种(属)中的同源蛋白，建立同源蛋白的数据库。根据相似度最高的同源蛋白出现的菌种范围不同，将89K致病岛进行分区，将89K致病岛分为了保守区和非保守区。
　　 (2)89K致病岛重组热点分析。利用EMBOSS软件绘制89K致病岛G+C含量分布曲线图，根据G+C含量的不同进一步验证89K致病岛的嵌合结构特征。
　　 (3)对89K致病岛的各区域功能进行分析。在对89K致病岛进行分区
　　 的基础上，将每个分区的ORF分别提交蛋白质序列数据库Uniprot，及蛋白质家族数据库Pfam，根据同源比对结果，及蛋白质中的保守结构域分析，对89K致病岛各ORF进行功能预测，推测每一个分区的基因簇可能代表的功能。其意义在于，如果每一个分区内，各基因功能相关，将进一步证实分区的合理性，同时，对保守区和非保守区的功能推断，有助于我们推测该致病岛家族可能的整合机制。
　　 (4)基因组岛家族的鉴定：根据前面的分析结果，我们推测89K致病岛是在四个保守区的基础上逐步整合而来，四个保守区域是一大类基因组岛家族的共同祖先序列，为了证实我们的假说，我们利用比较基因组法和碱基组成分析法对该基因组岛家族进行了鉴定，确认这些假定的基因组岛成员满足基因组岛的一些基本特征，为我们研究89K致病岛及其他同源基因组岛如何由一个共同祖先序列分化而来提供了线索。
　　 (5)系统发育及基因组岛比较分析。为了进一步说明该家族成员如何由一个共同祖先进化而来，我们首先对该家族成员进行了系统发育分析。保守区作为该致病岛家族进化过程中的骨架基础，因此我们利用保守区基因所构建的系统发育树来表示89K致病岛进化所经历的过程。从同源蛋白数据库中分别挑选与每个ORFs相似度最高的蛋白质序列(identity>50%)，对保守区的ORF构建同源蛋白系统发育树，比较系统发育树的拓扑结构，将基因组岛家族细分为多个亚家族。在划分亚家族的基础上，我们对各亚家族内部成员以及亚家族之间进行比较分析，推测从共同祖先开始，该家族经历了哪些进化途径，最终形成了在链球菌中的多态性分布。通过对该基因组岛家族的分析，不仅探索了该基因组岛家族如何从共同祖先开始进行分化，并对89K致病岛的具体整合过程有了一个明确的认识。
　　 综上所述：本研究获得了89K同源序列分布的大量信息，通过对同源蛋白数据库的分析，为探索89K致病岛各部分的来源找到了突破点。通过重组热点分析，验证了89K致病岛的嵌合结构特征；通过功能分析，我们发现了89K致病岛的模块化结构特征；此外，我们鉴定出了与89K致病岛同源的基因组岛家族，对该家族成员进行系统发育分析、比较基因组学分析，推测了该家族成员“单祖先，多途径”的分化历史。

目录

文摘

英文文摘

中英文名词缩写一览表

前 言

第一章 89K致病全序列同源比对及同源蛋白数据库的建立与分析

前 言

第一节 89K致病岛全序列的同源比对分析

数据与材料

实验方法

结果与讨论

第二节 同源蛋白数据库的构建及分析

数据与材料

实验方法

结果与讨论

第二章 重组热点分析

前 言

数据与材料

实验方法

结果与讨论

第三章 89K致病岛各区域功能及结构域分析

前 言

数据与材料

实验方法

结果与讨论

第四章 89K致病岛同源的基因组岛家族成员的鉴定

第一节 比较基因组学分析

数据与材料

分析方法

结果与讨论

第二节 基因组岛家族成员与全基因组的碱基组成比较

数据与材料

实验方法

结果与讨论

第三节 基因组岛的嵌合结构特征分析

数据与材料

实验方法

结果与讨论

第五章 89K致病岛及其基因组岛家族进化途径分析

前 言

数据与材料

实验方法

结果与讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 细菌的基因组岛

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章

附录 表1：同源蛋白数据库