HBx蛋白和CIITA转录表现遗传沉默在调控HepG2与L02细胞HLA-DR表达中的作用研究

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染已成为全球范围的严重公共卫生问题。HBV感染与原发性肝细胞癌关系密切，是我国原发性肝细胞癌的主要病因之一，而HBV感染导致肝癌发生、发展的确切机制至今尚未阐明。
　　 宿主免疫应答水平是影响肿瘤发生、发展与转归的主要因素之一。肝癌细胞免疫逃逸在原发性肝癌的发生、发展中发挥了重要作用，探讨肝癌细胞的免疫逃逸机制有助于制定针对肝癌免疫治疗的策略。主要组织相容性Ⅱ类分子(major histocompatibilitycomplexⅡ，MHC-Ⅱ)通过向Th细胞提呈外来抗原，在抗感染和抗肿瘤免疫中起重要作用。现有研究表明，肿瘤细胞缺乏HLA-DR(human leukocyte antigen DR，HLA-DR)表达是乳腺癌、结肠癌等发生免疫逃逸的重要机制之一。Ⅱ类反式激活因子(ClassⅡtransactivator，CIITA)是调控HLA-DR表达的“限速因子”，在调控HLA-DR表达与否及水平中起决定作用。报道指出，胃癌、结肠癌等肿瘤细胞中CIITA表达缺失是其缺乏诱导性HLA-DR表达的关键机制。我们以前的研究发现，HBV相关原发性肝细胞癌患者癌组织中的肝癌细胞缺乏CIITA与HLA-DR表达，而相应的癌周肝组织中的肝细胞存在不同程度的CIITA与HLA-DR表达，提示肝癌细胞缺乏HLA-DR表达可能与CIITA基因表达沉默有关、并在肝癌细胞免疫逃逸中起重要作用。然而，肝癌细胞CIITA基因表达沉默的机制尚未阐明。
　　 宿主基因启动子DNA甲基化和/或组蛋白的去乙酰化是导致宿主基因表达沉默的重要机制。已有研究显示，部分肿瘤细胞CIITA启动子Ⅳ甲基化和/或组蛋白去乙酰化是导致肿瘤细胞CIITA表达沉默和HLA-DR表达缺乏的关键表观遗传机制。在不同的肿瘤细胞中，导致CIITA基因转录沉默的表观遗传机制存在差异，在黑色素瘤细胞中由其启动子Ⅳ组蛋白去乙酰化所致，与甲基化无关；在胃癌、结肠癌细胞中则由其启动子Ⅳ甲基化单独所致；在白血病细胞中则由其启动子Ⅳ甲基化和组蛋白去乙酰化共同调控。在肝癌细胞中，与HLA-DR表达缺失相关的CIITA基因表观遗传沉默机制目前尚缺少研究。
　　 HBV基因组含有4个开放读码框架，其中X区所编码的产物HBx蛋白是一种多功能的调节蛋白，具有广泛的反式激活功能，既可激活信号转导系统，又可直接作用于细胞转录因子，还能通过上调DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶等的表达参与宿主基因的表观遗传调节，导致宿主基因的表观遗传沉默。近年研究发现X基因及其产物X蛋白与原发性肝细胞癌的发生密切相关，而HBx蛋白对抑癌基因的表观遗传修饰调控导致的基因沉默被认为是原发性肝细胞癌发生、发展的重要机制。由此推测，HBx蛋白有可能通过上调DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶等的表达参与诱导肝细胞或肝癌细胞CIITA基因转录表观遗传沉默。然而，HBx蛋白在调控肝细胞CIITA基因转录表观遗传沉默与HLA-DR表达中的作用尚无研究报道。
　　 首先，我们检测人正常肝细胞株L02细胞和人肝癌细胞株HepG2细胞中基础性及IFN-γ诱导性CIITA和HLA-DR的表达状况，并分析CIITA基因cDNA转染对HepG2细胞HLA-DR表达的影响，从而探讨HepG2细胞缺乏HLA-DR表达与CIITA基因表达沉默的关系；然后，采用MSP和ChIP技术检测L02细胞和HepG2细胞中CIITA启动子Ⅳ的DNA甲基化和组蛋白H3乙酰化状态，并分析甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达的影响，从而探讨CIITA启动子Ⅳ DNA甲基化和组蛋白H3去乙酰化在调控HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达中的作用；最后，构建HBV X基因真核表达载体，并分别转染L02细胞与HepG2细胞，探讨HBx蛋白对L02细胞与HepG2细胞CIITA和HLA-DR表达的影响。
　　 主要研究结果
　　 1、L02细胞中未检测到CIITA和HLA-DR的基础性表达，通过IFN-γ的刺激后检测到了CIITA和HLA-DR mRNA和蛋白的表达，且CIITA和HLA-DR的表达与IFN-γ呈一定的时间剂量依赖关系。HepG2细胞中，则未检测到CIITA和HLA-DR的基础性及IFN-γ诱导性表达。通过将CIITA真核表达载体转染HepG2细胞后，检测到HLA-DR的表达，转染空载体及HepG2细胞本身未检测到HLA-DR的表达。
　　 2、L02细胞中CIITA启动子Ⅳ DNA呈非甲基化状态，组蛋白H3呈乙酰化状态，HepG2细胞中CIITA启动子Ⅳ DNA呈半甲基化状态，组蛋白H3呈去乙酰化状态。通过采用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA单独及联合处理HepG2细胞后，结果显示TSA和5-Aza-CdR单独处理及两者联合处理，均能恢复IFN-γ诱导性CIITA mRNA的表达，以TSA单独处理组相对定量为1，5-Aza-CdR单独处理组相对值为1.15±0.27，两者联合处理组相对定量值为2.13±0.22，显著高于单独处理组，P<0.05；经5-Aza-CdR处理后恢复了HLA-DR蛋白的诱导性表达，经流式细胞技术检测，其表达率达11.9%±1.78%；经TSA处理后，HLA-DR蛋白的诱导性表达率达9.31%±2.24%；经两者联合处理后，HLA-DR蛋白的诱导性表达率达28.5%±2.81%，较两者单独处理明显升高(P<0.05)。
　　 3、构建HBV X基因真核表达载体，通过电穿孔方法转染L02细胞和HepG2细胞后，转染了HBVX基因的L02细胞中检测到了CIITA和HLA-DR的表达，同时，转染了HBV X基因的HepG2也检测到了HLA-DR的表达。
　　 结论
　　 1、CIITA基因表达沉默是导致HepG2细胞缺乏基础性与IFN-γ诱导性HLA-DR表达的关键机制；
　　 2、CIITA启动子Ⅳ的DNA甲基化和组蛋白H3去乙酰化修饰在导致HepG2细胞CHTA基因转录表观遗传沉默及HLA-DR表达缺失中均起重要作用，并可能是导致肝癌细胞免疫逃逸的重要机制；
　　 3、HBx蛋白能诱导L02和HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达，提示HBV相关性肝癌细胞CIITA表观遗传沉默所致的HLA-DR表达缺失与HBx蛋白无关。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写注释

前 言

第一部分 L02和HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达关系的研究

前 言

研究对象与方法

结 果

讨 论

第二部分 CIITA基因转录表观遗传沉默在调控HepG2细胞HLA-DR表达中的作用研究

前 言

研究对象与方法

结 果

讨 论

第三部分 HBx蛋白调控HepG2和L02细胞HLA-DR表达的研究

前 言

研究对象与方法

结 果

讨 论

全文结论

不足与展望

致谢

参考文献

文献综述 乙型肝炎病毒X蛋白与肝细胞性肝癌

参考文献

研究生阶段撰写的学术论文