Cajal间质细胞在膀胱胆碱能神经传递中作用的研究

摘要

背景及目的：
　　 膀胱的神经支配相当复杂，有不受意识控制的植物神经，也有受意识控制的体经因素；既有副交感神经，也有交感神经。当然，膀胱的神经支配主要为胆碱能神经。到目前为止，有关膀胱逼尿肌收缩的神经调控机制尚未完全阐明。总体上，膀胱被认为是平滑肌器官，但神经对膀胱的功能控制却具有类似于骨骼肌的随意控制的特点；同时膀胱又具有类似于胃肠及心脏的不依赖于神经的自主活动特征。因此传统理论将膀胱定义为介于自主和非自主神经系统支配之间的特殊的平滑肌器官。平滑肌细胞与神经末梢之间没有类似于骨骼肌的神经-肌肉接头这一结构，神经末稍与平滑肌之间也并非为一对一的关系。在这种神经支配方式下，神经释放神经递质通过细胞间液扩散，进而作用于其所支配的细胞，从而实现神经对所支配器官的功能调节。膀胱逼尿肌属于平滑肌组织，且正常膀胱逼尿肌细胞之间的主要连接方式为中间连接，其间隙为40～70nm；很少甚至缺乏间隙为2～3nm的缝隙连接和25～30nm的桥粒连接。从而可以推测，神经递质从释放到作用于逼尿肌细胞会存在时间延迟，而且因距离不等延迟的时间不同。而正常排尿时由神经触发协调一致的逼尿肌收缩。那么排尿时来自神经的信号是如何迅速地传递至整个膀胱逼尿肌细胞，引起逼尿肌即时、协调而有力的收缩呢？神经末梢与逼尿肌细胞之间是否存在某种传递信号的中间环节呢？
　　 自从发现膀胱内含有Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)以来，研究者对膀胱ICC的功能给予了极高的期待。因为在胃肠道中ICC在胃肠起搏、蠕动和神经传递等活动中起着重要的作用，它不仅作为胃肠蠕动基本电节律(basic electrical rhythm，BER)的起搏者，而且是壁内神经兴奋向平滑肌传递的“中转站”，并对有关信号起整合作用。那么，ICC在膀胱功能调控中会起着什么样的作用呢？形态学研究已经显示膀胱ICC有树枝状突起，单个的或树枝状的突起连接成一个细胞网，平行分布于平滑肌细胞周围；ICC与逼尿肌细胞和神经末梢间均存在密切联系，ICC与逼尿肌细胞之间存在缝隙连接。因此，自主神经系统、ICC和缝隙连接均参与了逼尿肌收缩的调节。膀胱ICC可能在神经兴奋从神经传递到逼尿肌细胞过程中起着“中转站”的作用。ICC要发挥“中转站”的作用，本身必须具有较高的可兴奋性。研究已经证实膀胱ICC具有许多离子通道及胆碱能受体、嘌呤能受体等神经受体；卡巴胆碱可以诱导离体培养的膀胱ICC细胞内钙离子浓度迅速升高，而这种细胞内钙离子浓度的增加并不导致ICC收缩。因此，来自神经的电信号就可以通过ICC网络迅速传导至整个膀胱逼尿肌细胞，从而及时启动逼尿肌协调一致地收缩。实际情况是否如此？膀胱ICC在神经末梢与逼尿肌细胞之间的信号传递中所起作用如何？这需要进一步深入的功能研究，也是本研究所关注的重点。
　　 由于膀胱ICC在体外难以纯化培养，且体外培养的ICC性质不稳定，其理化性质容易发生改变。所以，对ICC功能的研究就局限在原位/在体研究上，这造成对膀胱ICC的功能进行研究比较困难。最近，Garcia-Pascual等报道了采用电场刺激离体肌条研究尿道ICC在NO传递中作用及cGMP信号通路在其中的作用。研究认为，尿道ICC是NO作用的主要靶点，且是通过cGMP信号通路发挥作用的。这给我们以提示：可以通过电刺激来建立膀胱功能研究模型。通过查阅相关文献及大量的预实验，我们提出建立盆神经刺激在体模型，并用于膀胱功能研究。
　　 格列卫(甲磺酸伊马替尼)是c-kit的特异性拮抗剂。而c-kit是ICC的一个特异性受体，对于ICC的生长、发育、分化及其生理功能具有重要的调控作用。在膀胱，ICC和肥大细胞均表达c-kit，而上皮细胞、逼尿肌细胞和成纤维细胞等均不表达c-kit。格列卫经静脉注射后组织分布广泛，许多器官包括膀胱均有分布。所以可以用格列卫阻断ICC功能，观察ICC功能抑制后膀胱收缩功能变化，进而探讨ICC在膀胱功能调控中的作用。
　　 本课题目的在于：建立盆神经刺激在体模型，并利用此模型从功能学角度观察格列卫对刺激盆神经诱导的膀胱收缩反应的影响；同时从形态学角度观察ICC与膀胱胆碱能神经结构关系；进而从功能和形态来方面探讨ICC在膀胱胆碱能神经信号传递中作用。
　　 本课题以新近研究发现的膀胱ICC作为主要关注对象，以胆碱能神经信号为切入点，从一全新的层面解读膀胱功能调控机制，具有十分重要的理论价值，并可望为膀胱功能异常治疗提供新策略。
　　 方法：
　　 本课题以60～90d龄健康SD雌性大鼠为研究对象。第一部分我们建立并优化盆神经刺激在体模型。
　　 第二部分我们主要从功能学的角度探讨ICC作为逼尿肌神经调控的“中转站”的可能性。我们利用盆神经刺激在体模型，观察阿托品对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩的影响、格列卫对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩的影响、酮替芬对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩的影响；并利用全膀胱体外模型观察格列卫对外源性乙酰胆碱诱导的膀胱收缩的影响。
　　 第三部分我们从形态学研究ICC与胆碱能神经结构关系，初步探讨ICC具有作为逼尿肌神经调控的“中转站”的结构基础。
　　 结果：
　　 1.膀胱具有自发性收缩，0.2ml初始容量时膀胱自发收缩幅度为(4.0±0.5)cmH2O，0.4ml初始容量时膀胱自发收缩幅度为(10.1±1.0)cmH2O，而0.6 ml初始容量时膀胱自发收缩幅度为(17.9±2.3)cmH2O；三者间差异显著(F=135，55，p=0.000)。
　　 2.随着刺激强度、刺激脉宽的增加电刺激盆神经诱导的最大膀胱内压有升高的趋势。
　　 3.电刺激盆神经诱导的最大膀胱内压并不一直随着刺激时间的增加而升高；刺激时间超过10s后，刺激时间延长并不能使电刺激盆神经诱导的最大膀胱内压升高。
　　 4.间隔20分钟，连续(6次)刺激盆神经所诱导的膀胱收缩性无明显改变。说明在实验所涉及的刺激次数内，连续刺激对刺激盆神经所诱导的膀胱收缩性无明显影响。
　　 5.随着阿托品浓度的增加，电刺激盆神经诱导的最大膀胱内压逐渐降低趋势，而潜伏期有逐渐延长的趋势。即随着阿托品浓度的增加，电刺激诱导的膀胱收缩性能有降低的趋势。10μmol/L阿托品对刺激盆神经所诱导的最大膀胱内压抑制程度达85.4%。
　　 6.随着格列卫浓度的增加，电刺激盆神经诱导的最大膀胱内压逐渐降低趋势，而潜伏期有逐渐延长的趋势；但格列卫浓度超过1.0mmol/L以后，格列卫浓度的增加，电刺激盆神经诱导的最大膀胱内压降低不明显，而潜伏期延长亦不明显。
　　 7.100μmol/L酮替芬对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩性没有明显的影响。
　　 8.加入乙酰胆碱可明显诱导离体膀胱收缩，最大膀胱内压为(25.2±5.1)cmH2O；在有格列卫存在时加入乙酰胆碱仍然可明显诱导膀胱收缩，其最大膀胱内压为(24.7±6.0)cmH2O，两组间差异无明显的统计学意义(P=0.58，n=10)。
　　 9.SD大鼠膀胱肌层可见c-Kit染色阳性细胞，ICC主要分布于逼尿肌肌束边缘及逼尿肌肌束间，呈梭形，可有突起；SD大鼠膀胱肌层可见vAChT染色阳性细胞，尤其是在逼尿肌肌束边缘可见呈线条状排列的胆碱能神经纤维末梢；SD大鼠膀胱内vAChT阳性的神经末梢和c-Kit阳性的ICC在解剖位置上紧密相邻，c-Kit阳性的ICC细胞的突起与神经末梢接触紧密。
　　 结论：
　　 1.成功建立盆神经刺激在体模型，且证实本模型中电刺激盆神经所释放的神经递质主要为乙酰胆碱，为后续膀胱功能研究提供了一个良好平台。
　　 2.从形态和功能两方面证实，ICC参与了膀胱胆碱能神经对膀胱收缩功能的调控，ICC在膀胱胆碱能神经传递中起着重要作用，ICC可能在膀胱胆碱能神经兴奋从神经传递到逼尿肌细胞过程中起着“中转站”的作用。

目录

文摘

英文文摘

英文名词缩写一览表

前 言

第一部分 盆神经刺激在体模型的建立

实验一：膀胱容量对膀胱自发收缩的影响

材料与方法

结 果

实验二 初步建立盆神经刺激在体模型

材料与方法

结 果

实验三 刺激强度对膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

实验四 刺激脉宽对膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

实验五 刺激时间对膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

实验六 连续多次刺激对膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分 ICC在膀胱胆碱能神经传递中作用的功能研究

实验一：阿托品对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

实验二：格列卫对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

实验三：酮替芬对电刺激盆神经诱导的膀胱收缩反应的影响

材料与方法

结 果

实验四：格列卫对外源性乙酰胆碱诱导的膀胱收缩反应的影响--体外全膀胱研究

材料与方法

结 果

讨论

第三部分 大鼠膀胱ICC与胆碱能神经关系的形态研究

实验一：成年大鼠膀胱ICC免疫荧光鉴定

材料与方法

结 果

实验二：成年大鼠膀胱胆碱能神经免疫荧光鉴定

材料与方法

结 果

实验三：大鼠膀胱ICC与胆碱能神经末梢的关系

材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致谢

照 片

参考文献

文献综述一 膀胱Cajal间质细胞研究进展

参考文献

文献综述二 Cajal间质细胞与泌尿系统疾病关系的研究进展

参考文献

研究生期间发表的主要论文