嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤后肠ICC和Cx43影响的实验研究

摘要

重型颅脑损伤(severeheadinjury,SHI)后因中枢神经系统的受累、缺血再灌注的打击以及颅内压升高等因素,使得胃肠动力障碍(gastrointestinalmotilitydisturbances,GMD)的发生率高达80％以上,较其他创伤所致的GMD出现时间早,程度更重,严重影响救治效果和预后。临床上以肠动力不足更为常见。因此,有效恢复SHI后的肠动力有益于改善患者的临床结局。SHI后的肠动力不足主要表现为肠蠕动减慢或消失,迁移型复合波减少等。近年研究表明,Cajal间质细胞(interstitialcellsofCajal,ICC)是胃肠运动的起搏器及基本功能单位,其网络受损或缺失会导致胃肠动力异常。缝隙连接是介导胃肠平滑肌细胞和ICC间电化学信息交流的特殊通道。连接蛋白Cx43是此通道的结构基础,在ICC胞体和突起上均有表达,其表达异常亦与胃肠动力障碍密切相关。提示,维护肠道ICC网络及缝隙连接对扭转SHI后肠道动力不足,减少并发症的发生具有重要意义。
　　益生菌是具有双向调节胃肠动力且无药物毒副作用的一种微生态制剂,可以改善感染、功能性消化不良等疾病引起的胃肠动力不足[1-2]。本课题组研究发现,益生菌不仅能使SHI患者的排便时间显著提前;还可促进伤后大鼠的胃排空,改善肠道菌群失调等。但益生菌通过何种途径对创伤后胃肠动力进行的调控机制尚不清楚,因此有必要对其进行深入研究。为探讨其作用机理,本实验选用益生菌中重要的单菌之一嗜酸乳杆菌,采用自制圆柱套杆撞击器,使用改良的自由落体撞击法建立SHI后肠动力障碍小鼠模型,通过观察SHI后小鼠末端回肠离体肌条运动,检测肠肌丛ICC数量,观测小肠组织Cx43蛋白表达的变化,分析ICC、Cx43与SHI后发生肠动力不足的关系;同时通过观察嗜酸乳杆菌干预后对上述指标的影响,探讨嗜酸乳杆菌对小肠肌条收缩、ICC和Cx43的调节作用及可能机制,以期为嗜酸乳杆菌的临床应用提供理论依据。本研究数据均以均数±标准差(ˉx±s)表示,统计学处理采用SPSS17.0统计软件包进行单因素方差分析和独立样本T检验,P<0.05表示差异具有显著性统计学意义,P<0.01表示差异具有非常显著性统计学意义。
　　第一部分重型颅脑损伤小鼠肠动力障碍模型的建立
　　目的:成功建立SHI后肠动力障碍的小鼠模型,适用于SHI后肠动力不足的研究;且模型可操作性强,稳定性、重复性好,比现有颅脑损伤模型致死率低。
　　方法:60只健康雄性C57BL/6小鼠(体重21±3g),随机数字表法分为假伤组和创伤组,采用自制圆柱套杆撞击器对小鼠致伤,假伤组只开骨窗不致伤。伤后1h、6h、1d、3d、7d检测脑含水量,神经行为学变化,小肠推进率;光镜下观察脑、肠组织的病理学改变,判定损伤后是否存在肠动力障碍以构建SHI后肠动力障碍模型。
　　结果:创伤组小鼠打击后即刻出现原发性昏迷,伤后存在肢体活动受限,2~4h清醒后反应迟钝,1h、6h、1d、3d、7d的神经学评分较假伤组均有显著的统计学意义(P<0.01);与伤后1h比较,伤后3d、7d均有不同程度的改善(P<0.05,P<0.01);脑含水量在伤后1h即增加(P<0.05),6h增加明显(P<0.01),24h达峰值,3d后逐渐下降,7d后接近正常;脑组织病理变化符合重型颅脑损伤的变化过程。同时在致伤后1h,致伤组小鼠小肠推进率即下降(P<0.05),6h达到最低值,伤后1d小肠推进率持续下降(P<0.01);肠道病理亦显示出现急性炎症、出血和血管扩张等改变。以上特征提示该模型建立成功。
　　结论:制备的SHI后肠动力障碍小鼠模型,适用于损伤后肠动力障碍的实验研究。
　　第二部分嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤后肠ICC和Cx43影响的实验研究
　　目的:阐明重型颅脑损伤后肠动力障碍小鼠ICC及细胞连接蛋白Cx43的变化;探讨嗜酸乳杆菌对SHI后肠动力不足的改善作用,初步探明嗜酸乳杆菌保护损伤后肠运动功能的机理。
　　方法:72只清洁级雄性C57BL/6小鼠(体重20±2g)用第一部分方法致伤,按随机数字表法分为假伤组、创伤组和嗜酸乳杆菌组(嗜酸乳杆菌干预的创伤组),每组8只。各组均自由饮食,每天灌胃一次。嗜酸乳杆菌组于伤后6h将嗜酸乳杆菌(菌株为YIT2004,由上海信谊制药厂馈赠)溶于培养基中灌胃,每只小鼠喂养量不低1x1010cfu/d;假伤组、创伤组灌同体积培养基溶液。于伤后3、7、14d取材,通过多通道生理信号采集处理系统监测小鼠小肠离体平滑肌收缩运动,观察肌条收缩频率、幅度、张力的变化。免疫荧光法检测ICC和Westernblot法检测Cx43的变化。
　　结果:
　　1.小肠离体肌条收缩运动
　　①假伤组各时相点肌条收缩模式规律,呈正弦波,波形光滑、连续。②伤后3d、7d,创伤组肌条运动与假伤组比较,平滑肌收缩幅度减弱、张力降低及频率减少,差异有统计学意义(P<0.01),且收缩节律紊乱,波动时高时低,甚至波幅消失,且放大相同倍数后波形多锐化;14d时频率与假伤组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。③嗜酸乳杆菌组伤后3d、7d肌条收缩张力及频率较假伤组有不同程度紊乱(P<0.05),但相对创伤组,3d肌条收缩张力具有统计学差异(P<0.05)。同时其运动模式规律,收缩幅度和频率均有明显提高(P<0.01),且放大后波形连续,多数波形光滑,少数呈尖锐化。
　　2.小肠Cajal间质细胞(ICC)的形态与数量
　　①假伤组,小肠肠肌丛ICC呈长梭型或星状,细胞核大且DAPI染色清晰,有2~3个长分支,并与肌纤维或神经纤维平行走行,相互间形成完整网络样结构,网络密集。②创伤组,各时相点的末端回肠ICCkit阳性细胞数量减少,显著低于假伤组(P<0.01),ICC分支变少且网络稀疏,相互间以及与平滑肌间出现较大的细胞间隙;③而嗜酸乳杆菌组3d的末端回肠ICC细胞数量明显少于假伤组(P<0.05),14d仍未达到假伤水平;但与创伤组相比,嗜酸乳杆菌组3d、7d、14d的细胞数量均显著增多(P<0.01),网络明显增多、密集。
　　3.肠组织缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达
　　创伤组各时相点与假伤组比较,Cx43蛋白表达量下降,差异均有统计学意义(P<0.01);嗜酸乳杆菌组相对假伤组,虽然7d蛋白表达量有显著下降(P<0.01),但与创伤组比较,3d、14d蛋白表达量均明显高于创伤组(P<0.01,P<0.05)。
　　结论:
　　1.重型颅脑损伤后3d即出现肠道平滑肌自主收缩运动紊乱,收缩幅度和频率降低,收缩运动减弱。
　　2.重型颅脑损伤后肠肌丛ICC发生损伤,其数量减少,网络结构被破坏,且损伤后修复至少需要14d;重型颅脑损伤后肠组织Cx43表达减少,细胞连接受损。
　　3.肠肌丛ICC数量减少和网络受损,以及Cx43的表达缺失或减少,是造成肠神经-ICC-平滑肌网络结构电信号传递障碍,引起肠道收缩模式紊乱,导致脑损伤后动力障碍的可能机制之一。
　　4.嗜酸乳杆菌能改善重型颅脑损伤后肌条幅度降低,频率减少,张力降低而导致的收缩性减弱;降低ICC数量减少的程度,增加缝隙连接蛋白Cx43的表达,修复胃肠道基本功能单位的网络状结构,使其发挥正常作用。
　　5.嗜酸乳杆菌能改善重型颅脑损伤后肌条收缩模式紊乱,提高肠动力,可能与保护了ICC的功能或是减轻ICC的损伤程度,恢复其数量及网络结构有关;同时也与增加伤后连接蛋白Cx43的蛋白表达,恢复伤后细胞间连接有关。

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缩略语表

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中文摘要

第一章 前言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 重型颅脑损伤小鼠肠动力障碍模型的建立

2.1 材料与方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

2.4 小 结

第三章 嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤后肠ICC和Cx43影响的实验研究

3.1 材料与方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

3.4 小 结

全文总结

创 新 点

实验的不足之处

参考文献

文献综述创伤后胃肠道ICC及缝隙连接的研究进展

参考文献

硕士期间撰写与发表的文章

致谢