钩藤总碱提取工艺优化及其抗焦虑作用药效学和作用机制的初步研究

摘要

1.目的
　　钩藤属茜草科植物,带钩茎枝入药,性凉、味甘苦,具有清热平肝、息风定惊的功效,其作为我国传统中药已有悠久的使用历史。现代实验研究表明,钩藤生物碱除了具有对心血管系统、血液系统及免疫系统等药理作用外还对中枢神经系统产生影响,例如镇静、抗惊厥、抗癫痫、抗焦虑等。目前国内外对钩藤生物碱的药理作用研究多集中在钩藤碱、异钩藤碱的降压和脑缺血保护等药理作用上,对其可能的抗焦虑药效学还少见报道,考虑到钩藤生物碱对中枢神经系统的功能产生影响,且具备天然药物成分安全性较高的特点,有必要对其抗焦虑活性进行深入研究。
　　本课题首先对钩藤总碱(RTA)四个主要有效成分建立检测时间快、分离效果好的高效液相色谱法(HPLC-UV)分析方法,为钩藤总碱提取工艺、含量测定及稳定性考察奠定定量分析方法;通过含量测定分析方法研究对钩藤总碱的提取工艺优化,建立提取效率高、方法简易可行且安全的钩藤总碱(RTA)提取工艺,为后续进一步探讨其抗焦虑药效及作用机制的初步研究奠定物质基础;采用不同的国际通用的抗焦虑动物模型,观察钩藤总碱对动物行为学的影响考察其抗焦虑作用;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测钩藤总碱对EPM干预前后大鼠脑组织内单胺类递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)的含量变化,认识其可能相关的作用机制。为寻求有效且副作用更小的天然抗焦虑药物,为我国传统中药钩藤的药物研发奠定实验基础。
　　2.方法
　　2.1钩藤总碱的含量测定研究对提取钩藤总碱中主要有效成分钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱4个四元环氧化吲哚生物碱建立检测时间快、分离效果好的HPLC-UV分析方法,通过分离特异性、线性范围、准确度、精密度、重复性和稳定性对所建方法考察确证。
　　2.2钩藤总碱提取工艺优化的单因素影响研究通过薄层色谱法定性分析鉴别购买钩藤药材;对几个不同产地的普通钩藤药材进行筛选,确定钩藤碱含量高的产地钩藤作为提取工艺的药材;以钩藤碱的产率为响应值,在前期预实验考察基础上以乙醇超声提取法为基础,采取冷浸时间、乙醇百分比、酸化条件、萃取溶剂、萃取溶剂比及萃取次数多个单因素影响进行考察。
　　2.3钩藤总碱提取工艺正交试验优化研究在单因素影响研究基础上以3个主要因素物料比为1:5、1:10、1:15,提取次数为1次、2次、3次,超声时间为1h、2h、3h,开展三因素三水平的正交实验(L933),进一步确定钩藤总碱的最优提取工艺。
　　2.4钩藤总碱抗焦虑作用初步药效学研究以地西泮作为阳性对照,对自提钩藤总碱通过大/小鼠高架十字迷宫实验、小鼠明暗穿箱实验、小鼠避暗实验、小鼠期待性焦虑实验和小鼠戊四唑抗惊厥实验几个通用的动物焦虑模型进行抗焦虑作用的初步药效学研究。
　　2.5钩藤总碱抗焦虑作用初步作用机制研究:采用ELISA试剂盒测定EPM干预前后大鼠脑组织中去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)三种单胺类神经递质含量变化,考察其可能的作用机制。
　　3.结果
　　3.1钩藤总碱的含量测定研究高效液相色谱法紫外检测确定分析波长为245.4nm,色谱分离条件为以Welchrom-C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱为固定相,流动相体系为0.01mol/L磷酸二氢钾(HCl调PH2.85)-乙腈(70:30),以柱温25℃、流速1.0mL/min梯度洗脱,0~10min内洗脱比例由70:30线性递减至65:35。该条件下钩藤总碱样品的主要有效成分(钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱)保留时间分别于共存杂质有效分离。该分析方法确证结果显示线性回归方程分别为钩藤碱:y=6.17×104x-2.17×104(0.52~66μg/ml,r2=0.998),异钩藤碱:y=5.77×104x-1.20×104(0.46~59μg/ml,r2=0.997),去氢钩藤碱:y=6.38×104x–1.45×104(0.48~61μg/ml,r2=0.998),异去氢钩藤碱:y=5.54×104x-1.86×104(0.45~58μg/ml,r2=0.998);准确度实验结果钩藤碱低、中、高浓度加样回收率分别为103％、94.8%、113%;异钩藤碱低、中、高浓度加样回收率分别为88%、90%、100%;去氢钩藤碱低、中、高浓度加样回收率分别为92%、88%、98%;异去氢钩藤碱低、中、高浓度加样回收率分别为106%、113%、108%;精密度结果显示钩藤碱日内精密度分别为1.76%、3.70%、7.76%;异钩藤碱日内精密度分别为1.07%、3.78%、6.39%;去氢钩藤碱日内精密度分别为2.10%、3.48%、6.39%;异去氢钩藤碱日内精密度分别为1.62%、3.50%、9.92%;提取总碱重复性实验钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的含量RSD值分别为1.52%、1.97%、1.81%、1.66%,重复性好;提取总碱溶液在室温放置1、2、3、4、5天后钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱含量RSD值分别为7.55%、8.64%、6.84%、7.87%,冷藏(4℃)的1、2、3、4、5天其含量RSD值分别为4.78%、4.6%、3.77%、2.93%,室温和冷藏5天稳定性均良好。
　　3.2钩藤总碱提取工艺优化的单因素影响研究薄层色谱法定性分析鉴别后,对几个不同产地的普通钩藤药材进行筛选,以钩藤碱的产率为响应值,结果显示湖南钩藤提取率较高,确定作为药材基础。通过以上多个单因素影响考察,综合评价,结果以冷浸24h、80%乙醇、0.2%HCl酸化、三倍量氯仿萃取3次为最佳初提工艺。
　　3.3钩藤总碱提取工艺正交实验优化研究在单因素影响确定的初提工艺基础上通过三因素三水平的正交实验(L933)优化,实验结果显示以物料比为1:10、提取次数为3次、超声时间为2h作为最佳优化条件,最后确定建立了提取率高、方法简易可行且安全的钩藤总碱提取工艺:物料比1:10,0.2%HCL酸化的80%乙醇冷浸24h,超声2h提取3次,提取液回收乙醇后得到浓缩液氨水调pH10~11,三倍量氯仿萃取3次,回收,真空干燥(<80℃)。该提取工艺提取率达0.2%。
　　3.4钩藤总碱抗焦虑作用初步药效学研究自制钩藤总碱在设计的几个不同的动物焦虑模型上,分别表现出不同程度的抗焦虑药效,在大、小鼠高架十字迷宫实验和小鼠期待性焦虑实验上尤为显著:与空白对照组比较,RTA3个剂量组大鼠OE%和OT%显著高于空白对照组(P<0.05),与DZP阳性对照组比较,没有统计学差异(P<0.05);空白对照组显示出应激性体温升高现象,阳性对照组和RTA3个剂量组小鼠均未产生此现象,表现出抗焦虑作用。结果表明钩藤总碱具有一定的抗焦虑药效。
　　3.5钩藤总碱抗焦虑作用初步作用机制研究通过ELISA测定EPM干预前后大鼠脑组织中去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)三种单胺类神经递质含量,结果显示RTA组与空白对照组相比,可使EPM大鼠脑内NA、DA和5-HT含量产生显著减少,表明RTA对焦虑后的单胺类神经递质具有调节作用,可能是其抗焦虑作用机制之一。
　　4.结论
　　4.1建立了钩藤总碱样品的主要有效成分(钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱)含量测定的HPLC-UV分析方法,该方法检测时间快、分离效果好,在特异性、准确性、灵敏性、重现性等方面均可满足钩藤总碱测定需求。
　　4.2确定建立了提取率高、方法简易可行且安全的钩藤总碱提取工艺:物料比1:10,0.2%HCL酸化的80%乙醇冷浸24h,超声2h提取3次,提取液回收乙醇后得到浓缩液氨水调pH10~11,三倍量氯仿萃取3次,回收,真空干燥(<80℃)。该提取工艺提取率达0.2%。
　　4.3钩藤总碱在实验设计动物模型分别显现出不同程度的抗焦虑药效,在大、小鼠高架十字迷宫实验和小鼠期待性焦虑实验上尤为显著,结果表明钩藤总碱具有一定的抗焦虑药效。其对焦虑模型后的单胺类神经递质具有调节作用,可能是其抗焦虑作用机制之一。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 钩藤总碱HPLC-UV含量测定方法研究

2.1 实验仪器和试剂

2.2 实验方法

2.3 统计分析

2.4 实验结果

2.5 本章小结讨论

第三章 钩藤总碱的提取工艺优化

3.1 实验仪器和试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 本章小结讨论

第四章 钩藤总碱的抗焦虑初步药效学研究

4.1 实验仪器和试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 本章小结讨论

第五章 钩藤总碱的抗焦虑作用机制初步研究

5.1 实验仪器和试剂

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 本章小结讨论

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢