ROS在Bcl-2抑制剂抗淋巴瘤和肝细胞癌中的作用及机制研究

摘要

研究背景:
　　诱导细胞凋亡是肿瘤治疗最基本的理念之一,Bcl-2家族抗凋亡蛋白作为目前研究最深入的调控线粒体途径凋亡的一类分子,其靶向抑制剂的开发和机制研究成为了近年来的热点。靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白的小分子化合物在许多临床前期实验中已被证实具有较好的抗瘤效应。淋巴瘤和肝癌作为我国发病率较高的恶性肿瘤,死亡率较高,目前的治疗措施效果不够理想,副作用较大,急需靶向性较强的药物。前期大量研究已经证实淋巴瘤和肝癌的发生、发展及治疗抵抗均与Bcl-2家族抗凋亡蛋白的过表达密切相关,是应用Bcl-2抑制剂进行靶向治疗的理想模型。ROS是细胞在代谢过程中产生的活性氧簇,密切参与了多种生理及病理过程的调节。近年来ROS在调控细胞自噬和凋亡中的双重作用越来越受到关注,但有关Bcl-2抑制剂诱导的ROS在抗癌中的具体作用和机制还不清楚,亟待深入阐明。
　　研究目的:
　　ROS在Bcl-2抑制剂抗淋巴瘤和肝细胞癌中的作用及机制研究。
　　研究方法:
　　选取人淋巴瘤细胞系Namalwa和肝癌细胞系HepG2、Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5为细胞模型。将不同浓度的Bcl-2抑制剂在不同时间点处理细胞后,采用CCK-8检测细胞存活率,台盼蓝计数细胞总的死亡率,TUNEL-FITC检测凋亡细胞数量,Westernblot检测凋亡相关分子变化,ELISA试剂盒检测Caspase3酶活性变化。用Bcl-2抑制剂处理细胞后,Westernblot检测自噬相关蛋白LC3和P62变化,并用荧光显微镜观察GFP-LC3形成自噬小体情况,DCFH-DA荧光探针检测细胞内总ROS的变化。Bcl-2抑制剂单独或联合抗氧化剂NAC或JNK抑制剂处理细胞后,Annexin-PI染色观察细胞凋亡变化,Westernblot检测凋亡及自噬相关分子的变化。
　　研究结果:
　　1.ROS在左旋棉酚抗淋巴瘤中的作用及机制。
　　(1)左旋棉酚剂量依赖性地抑制淋巴瘤Namlaw细胞的增殖并促进细胞的死亡;(2)左旋棉酚能升高Namlaw细胞内的ROS水平;
　　(3)抗氧化剂NAC可抑制左旋棉酚诱导的细胞自噬;
　　(4)抗氧化剂NAC阻止左旋棉酚介导的HMGB1从胞核到胞质的转位;
　　(5)抗氧化剂NAC显著促进了左旋棉酚的促细胞凋亡能力。
　　2.ROS在新型棉酚衍生物ApoG2抗肝细胞癌中的作用及机制。
　　(1)ApoG2诱导了肝癌细胞HepG2和Hep3B的自噬发生;
　　(2)ApoG2打断了Belin1和Bcl-2之间的相互作用;
　　(3)ApoG2促进了HepG2和Hep3B细胞ROS的升高;
　　(4)ApoG2诱导的自噬能被抗氧化剂NAC所拮抗;
　　(5)抗氧化剂NAC增强了ApoG2诱导细胞凋亡的能力。
　　3.ROS在ABT-737抗肝细胞癌中的作用及机制。
　　(1)高表达Bcl-2和Bcl-xl的HepG2和Hep3B细胞系对ABT-737不敏感,而高表达Bcl-xl但无表达或低表达Bcl-2的肝癌细胞系对ABT-737较为敏感;
　　(2)ABT-737在HepG2细胞更容易诱导细胞自噬发生;
　　(3)ABT-737在HepG2细胞和Huh7细胞均诱导了ROS的升高,在Huh7细胞变化更为明显;
　　(4)ABT-737通过ROS差异性地激活了JNK,ABT-737在HepG2细胞早期瞬时激活JNK,而在Huh7细胞则持续激活JNK;
　　(5)在HepG2细胞,ABT-737联合抗氧化剂NAC或JNK抑制剂SP600125均抑制了细胞自噬水平,促进细胞的凋亡;在Huh7细胞,抗氧化剂NAC或JNK抑制剂SP600125均抑制了ABT-737诱导的细胞凋亡。
　　结论:
　　(1)左旋棉酚能通过ROS诱导淋巴瘤细胞发生自噬,这种自噬是利于细胞存活的,抗氧化剂能通过抑制自噬促进左旋棉酚诱导的细胞凋亡;ROS介导自噬发生可能与胞核HMGB1向胞质的转位增加有关。
　　(2)ApoG2能通过ROS诱导肝癌细胞发生保护性自噬,其机制涉及ROS介导的ERK和JNK通路激活以及胞核HMGB1向胞质的转位增加;抗氧化剂NAC能增强ApoG2的抗瘤效应。
　　(3)不同肝癌细胞系对ABT-737的敏感性不同,ROS-JNK通路的激活程度不同是造成这种差异性的重要原因。在高表达Bcl-2的HepG2细胞,ABT-737通过激活低水平的ROS在早期瞬时激活了JNK;在低表达Bcl-2的Huh7细胞则通过激活高水平的ROS持续激活了JNK;ABT-737激活的ROS-JNK信号通路在HepG2主要诱导细胞自噬发生来促进细胞存活,而在Huh7细胞则主要促进细胞凋亡。以上研究为Bcl-2抑制剂在淋巴瘤和肝癌治疗过程中可能出现的抵抗问题提供了新的思路,为Bcl-2抑制剂更好地应运于临床提供了一定的实验依据。

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缩略语表

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第一章 前 言

第二章 ROS在左旋棉酚抗淋巴瘤中的作用及机制研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小 结

第三章 ROS在新型棉酚衍生物ApoG2抗肝细胞癌中的作用及机制研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 ROS在ABT-737抗肝细胞癌中的作用及机制研究

4.1 材料与方法

4.2 结 果

4.3 讨论

4.4 小结

全文总结

参考文献

文献综述Bcl-2分子与自噬的研究进展

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文和申请国家发明专利情况

致谢