超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢并修复糖尿病肾病的实验研究

摘要

研究背景:
　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是终末期肾脏疾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因,与ESRD较高的死亡率密切相关。目前广泛认为小管间质损害是ESRD可靠的预测因子并与肾功能障碍密切相关。微量白蛋白尿是糖尿病肾病的早期征象。现有许多证据表明对糖尿病肾病进行早期干预和精确调控可以减缓,甚至逆转糖尿病肾病的进程。因此,对早期糖尿病肾病进行及早干预、提高治疗物质在肾间质的聚集是目前医学领域亟待解决的问题。目前治疗糖尿病肾病的常用方法诸如调控血糖、胰腺和肾脏移植、透析治疗等虽然能改善肾功能,却因当前药物治疗和治疗技术的有限性,导致并发症多、生存质量不高,效果并不显著。
　　骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)移植治疗是近年来国内外研究的重点,其易于分离提取,具有高度的扩增潜能,有良好的基因稳定性、组织相容性好、不涉及伦理道德问题,为受损组织和器官的修复开辟了一条新途径。MSCs能够分化为功能性的胰岛素生成细胞,逆转糖尿病大鼠高血糖状态,也能够分化为肾脏细胞修复受损肾脏。因而,MSCs移植治疗被认为是改善高血糖和肾功能的、具有极大吸引力的治疗手段。但骨髓中MSCs含量极少,远远小于肾脏修复所需要细胞的量,加上目前干细胞移植治疗移植后细胞存活率较低、干细胞靶向归巢能力欠佳等问题,均极大地限制了其应用。因此,如何调控骨髓干细胞的肾向性、提高干细胞靶向归巢能力和移植的有效性是干细胞移植治疗肾脏疾病的关键。
　　超声介导的微泡破坏(Ultrasound-mediated microbubble destruction)作为一种新的、极具前景的治疗方法应用于多个领域,例如将药物和基因传递到心血管系统,开放血脑屏障和血瘤屏障,增强毛细血管和血管通透性以及促进干细胞归巢等。肾脏是高滤过器官,对生物学效应较为敏感,对于肾脏疾病的干细胞移植治疗,超声介导的微泡破坏作用是否同样有效呢?研究显示,超声基因转染治疗仪(1.0W/cm2)联合自制微泡能有效促进MSCs归巢至肾脏,使急性肾损伤大鼠肾功能得到明显改善。该研究还发现,超声+微泡组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达高于对照组、超声+微泡+MSCs组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达高于单纯MSCs移植组,说明超声介导的微泡破坏可以增加MSCs的靶向黏附、提高MSCs归巢至肾脏的能力,进而更有效地实现MSCs靶向移植治疗肾脏疾病的效果。
　　然而,关于慢性肾脏疾病的干细胞治疗,超声介导的微泡破坏作用对其影响的研究较少,本实验尝试利用超声介导的微泡靶向破坏作用,经静脉移植MSCs治疗链脲佐菌素(strep to zotocin,STZ)诱导的1型糖尿病肾病大鼠,并试图探索其安全性及可能机制,期望能提供一种新的、非侵入性的方法,对糖尿病肾病患者给予系统性药物治疗的前提下选择性增强干细胞在肾脏的聚集,最大化提高糖尿病肾病的治疗效果,为提高干细胞无创、有效地靶向归巢及减缓疾病进程、或是逆转糖尿病肾病病程进展提供一种新思路和新方法。
　　研究目的:
　　1.探讨诊断超声介导的微泡破坏促进经静脉移植的同源异体MSCs归巢糖尿病肾病大鼠肾脏的可行性和安全性;
　　2.探讨在诊断超声介导的微泡破坏作用下,经静脉移植的MSCs对修复大鼠糖尿病肾病的有效性;
　　3.初步探讨诊断超声介导的微泡破坏技术对促进静脉移植的MSCs靶向归巢并修复大鼠糖尿病肾病的可能机制。
　　研究方法:
　　1.采用全骨髓培养法对SD(Sprague Dawley)大鼠骨髓MSCs进行分离、培养、及纯化,检测其生物学特性。流式细胞仪检测细胞表面标记分子,成脂、成骨诱导分化进行细胞鉴定。为便于对体内干细胞的追踪,采用携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒对培养的MSCs进行转染,并观察转染后MSCs表达绿色荧光情况及细胞毒性反应。
　　2.腹腔单次注射60mg/KgSZT建立稳定的大鼠1型早期糖尿病肾病模型,随机血糖浓度和尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAER)评价模型是否成功建立。
　　3.①观察eGFP标记的MSCs归巢肾脏的情况。模型大鼠被随机分为MSCs组和超声+微泡+MSCs组,两组均经尾静脉移植MSCs,72h后采用激光共聚焦显微镜观察eGFP标记的MSCs在肾脏的定植情况,观察MSCs在MSCs组与超声+微泡+MSCs组肾脏内的荧光分布并进行阳性细胞计数和统计学比较。②超声介导的微泡破坏对糖尿病肾病模型大鼠肾脏通透性的影响。模型大鼠被随机分为三个批次,每一批次均分为对照组(未处理组)、超声组、微泡组与超声+微泡组。第一批次大鼠在注射伊文思蓝(evansblue,EB)同时接受相应处理,1小时后检测EB含量、激光共聚焦显微镜及透射电镜观察各组毛细血管通透性改变,实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测E选择素(E-selectin)的mRNA和蛋白表达,肾脏组织学观察超声介导的微泡破坏对组织结构的可能损害;第二批次大鼠(处理同第一批次)24小时后检测UAER评价超声介导的微泡破坏对肾脏滤过功能可能的影响;第三批次大鼠(恢复组)接受相应处理后24小时再接受EB注射,观察毛细血管通透性的恢复。
　　4.模型大鼠被随机分为正常非糖尿病肾病组、未治疗组、超声+微泡组、MSCs组与超声+微泡+MSCs组。给予相应处理后1、2、4、8周每周固定时间点检测各组随机血糖浓度。8周后,检测大鼠UAER和血浆胰岛素水平、透射电镜观察肾小球和肾小管超微结构、肾脏PAS染色和胰腺HE染色观察肾脏和胰腺病理结构,胰腺组织免疫荧光双标技术观察胰岛β细胞和α细胞分布及数量恢复,酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗炎因子白细胞介素10(IL-10)的蛋白表达,免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测促纤维化因子TGF-β1在肾内的分布和表达,并进行半定量分析。
　　结果:
　　1.培养的MSCs贴壁生长,形态以梭形为主;细胞表面高表达CD44(99.44％)和CD90(99.37%),几乎不表达CD34(1.17%)和CD45(7.12%)。成脂诱导培养1周后油红O染色显示胞浆红色脂滴形成,成骨诱导2周后茜素红S染色显示红色钙结节形成。选择感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为10转染MSCs,转染后72h荧光显微镜下观察,绝大部分MSCs呈现明亮的绿色荧光,eGFP转染阳性率约90%。转染后MSCs形态仍为梭形,生长良好,未见明显毒性反应,传代后荧光表达稳定。
　　2.STZ注射3天后,大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿、精神萎靡、活动减少、反应迟钝、鼠毛稀疏、晦暗无光泽等体征,连续3天监测随机血糖浓度均大于16.7mmol/L,提示1型糖尿病模型建立成功。糖尿病模型成功建立后4周,血糖值稳定在20.8-33.8mmol/L之间,大鼠出现微量白蛋白尿,UAER值从(18.64±6.43μg/mg,对照组)升高至(46.79±15.42μg/mg,糖尿病肾病组)。胰腺及肾脏病理学均提示早期糖尿病肾病模型成功复制。
　　3.①荧光显微镜计数并比较MSCs组与超声+微泡+MSCs组肾内eGFP阳性细胞数,分别为(5.7±0.8)个,(18.3±2.9)个,差异有统计学意义(P<0.01)。eGFP标记的MSCs主要位于肾间质毛细血管外、管周区域,少数位于肾小球。②超声联合微泡组肾内EB蓝染面积最明显,表面与冠状面蓝染面积分别为(49.12±7.31)%和(37.99±4.36)%,超声组肾内有轻微蓝染,表面与冠状面蓝染面积分别为(9.37±3.45)%和(10.10±3.24)%,对照组和微泡组未见蓝染。③超声联合微泡组的EB含量(37.267±4.948μg/g)明显高于对照组(13.942±2.848μg/g)、超声组(14.126±2.570μg/g)、微泡组(13.969±2.076μg/g)和恢复组(14.658±3.916μg/g)。④激光共聚焦结果显示超声+微泡组肾间质毛细血管周围EB渗出较其他组为明显,似呈“渔网状”,余各组未见EB渗出。⑤透射电镜观察到超声辐照后间质毛细血管壁变薄,变得不连续、不光滑,对照组、超声组和微泡组的间质毛细血管保持完整。⑥超声+微泡组E-selectin的mRNA和蛋白表达明显高于对照组、超声组和微泡组。⑦肾脏HE染色后观察,各组肾脏组织没有出血、坏死和肾脏结构的改变。⑧各组之间UAER值没有统计学差异。⑨各组未见血尿。
　　4.①细胞治疗后1周,MSCs组和超声+微泡+MSCs组血糖浓度明显降低。细胞移植后第2周,血糖浓度降到最低水平并持续至整个实验阶段。细胞治疗后8周,MSCs组和超声+微泡+MSCs组,血糖浓度无明显差异(23.8±5.5mmol/L&24.0±4.6mmol/L,P=0.395)。未治疗组和超声+微泡组直至实验结束仍保持较高血糖水平,浓度分别为(28.4±6.2)mmol/L及(27.9±6.5)mmol/L。②细胞治疗后8周,与正常组(25.27±2.34mIU/L)相比,未治疗组和超声+微泡组的血浆胰岛素水平明显降低,分别为(16.42±2.17)mIU/L和(16.67±2.33)mIU/L,二者之间无明显统计学差异,而MSCs组和超声+微泡+MSCs组的血浆胰岛素水平有所上升,分别为(19.31±1.68)mIU/L和(19.53±1.59)mIU/L,二者之间也无明显统计学差异。③细胞治疗后8周,未治疗组和超声+微泡组的UAER值均保持较高水平,分别为(643.25±204.58)μg/mg和(637.29±212.24)μg/mg。该值约4倍高于同时期正常组大鼠UAER值(128.57±36.93μg/mg)。MSCs组和超声+微泡+MSCs组的UAER值明显降低,分别为(302.41±49.21)μg/mg和(252.83±39.58)μg/mg。尽管MSCs组和超声+微泡+MSCs组的UAER值均未降至正常水平,但超声+微泡+MSCs组的UAER水平明显低于MSCs组。④MSCs治疗后8周,未治疗组和超声+微泡组大鼠肾小球基底膜增厚,细胞外基质增生,系膜区增宽,足突广泛融合、增宽;肾小管上皮细胞胞浆内可见髓鞘样结构,小管上皮细胞微绒毛肿胀,线粒体肿胀并伴大量空泡变。MSCs组大鼠肾小球基底膜增厚、细胞外基质增生以及系膜区增宽情况减轻,小部分足突融合,大部分修复;肾小管上皮细胞部分线粒体肿胀伴少量空泡变性。超声+微泡+MSCs组大鼠肾小球基底膜大部分未见明显增厚,细胞外基质增生明显减轻,系膜区未见增宽,足突融合明显好转;肾小管上皮细胞线粒体轻度肿胀,未见明显空泡变性。⑤肾脏PAS染色显示,至整个实验结束,未治疗组与超声+微泡组的肾小球和肾小管在光镜下有类似改变,均表现为肾小球硬化、体积增大、基底膜增厚、系膜区增宽、系膜基质增生和肾小管扩张,肾小管上皮细胞空泡变性。

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缩略语表

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摘要

第一章 前言

第二章 大鼠骨髓源性MSCs的分离、培养、鉴定与标记

2.1 材料与方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

2.4 小 结

第三章 大鼠早期糖尿病肾病模型的建立与评价

3.1 材料与方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

3.4 小 结

第四章 超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢早期糖尿病肾病大鼠肾脏的研究

4.1 材料与方法

4.2 结 果

4.3 讨 论

4.4 小 结

第五章 超声介导的微泡破坏促进MSCs移植修复糖尿病肾病大鼠的研究

5.1 材料与方法

5.2 结 果

5.3 讨 论

5.4 小 结

全文总结

参考文献

文献综述一干细胞移植在肾脏疾病中的应用

参考文献

文献综述二超声彩色显像及造影技术在肾脏疾病中的应用

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢