替米沙坦激活过氧化物酶体增殖物活化受体δ改善小鼠胰岛素抵抗及其机制研究

摘要

背景和目的:
　　随着生活方式和饮食结构发生改变,肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的发病率逐年增高。2型糖尿病主要由胰岛素分泌不足或胰岛素功能障碍所引起。胰岛素抵抗是由于机体内一定量胰岛素的生物活性下降所致,包括胰岛素敏感性的下降和反应性降低。胰岛素抵抗与葡萄糖代谢异常密切相关,因此改善胰岛素抵抗及葡萄糖代谢紊乱,是防治2型糖尿病及相关代谢性疾病的重要途径。
　　血管紧张素Ⅱ型受体阻断剂(ARBs)作为一类治疗高血压药物,常用于治疗高血压患者合并糖尿病或糖尿病肾病。临床研究发现,ARB类药物可改善胰岛素抵抗、降低高血压患者糖尿病的发生率。近年来,一些ARB类药物,如替米沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦等,对胰岛素敏感性的作用也引起关注。临床研究表明,替米沙坦不仅能改善高血压合并2型糖尿病患者的胰岛素抵抗,稳定其血糖,还能增加非糖尿病患者的胰岛素敏感性。动物实验同样也证实,替米沙坦通过减轻炎症反应,改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗。
　　目前已证实,ARB类药物,如替米沙坦、缬沙坦等,可以有效的激活过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome prolifer atoractivated receptors,PPARs)。大剂量的替米沙坦可以通过激活PPARγ改善糖尿病合并高血压患者的胰岛素抵抗。而在脂肪组织中敲除PPARγ后,替米沙坦增加脂联素水平减少和胰岛素刺激下葡萄糖转运至脂肪组织中脂滴的敏感性明显下降。与此相反,肌肉特异性PPARγ缺失后,替米沙坦对脂联素水平或葡萄糖代谢,无论是在脂肪或肌肉上几乎没有影响。因此,替米沙坦增加脂肪组织中的葡萄糖利用的能力依赖于PPARγ的存在。替米沙坦减少糖尿病高血压大鼠模型的血清甘油三酯的增加和促进肝脏组织中的脂滴减少,其机制可能与替米沙坦恢复肝脏、脂肪、肌肉组织中PPARγ、PPARδ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活蛋白1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC1α)、脂联素、脂联素受体和葡萄糖转运子4的mRNA表达有关。因此,替米沙坦增加胰岛素敏感性的作用在临床及基础研究中均已得到证实,但是,目前研究尚不清楚替米沙坦引起机体整体葡萄糖代谢的改善,是否与骨骼肌葡萄糖转运系统的调节有关,替米沙坦具体通过何种分子或通路起作用,亟需进一步深入研究。
　　PPARδ(也称为PPARβ)在各种组织中广泛表达,尤其在骨骼肌中具有高表达水平,表达量分别是PPARγ、PPARα的50、10倍。最近的研究表明,PPARδ在骨骼肌中的葡萄糖代谢和胰岛素的作用中至关重要。Kramer等激活原代培养人骨骼肌细胞PPARδ,可以直接增加脂肪酸转运和葡萄糖摄取,促进血脂/血糖代谢及增加相关基因表达。Schuler等证实骨骼肌选择性PPARδ缺失后小鼠表现出肌纤维类型的转换、肥胖和2型糖尿病,表明PPARδ影响外周胰岛素敏感性。PPARδ激动剂使小鼠骨骼肌中线粒体的密度增加,增加骨骼肌中脂肪酸代谢的氧化酶和过氧化物酶体β氧化酶的表达。给予代谢综合征的患者PPARδ激动剂GW501516干预两周,通过增加患者骨骼肌的脂肪酸氧化,可以降低患者的空腹血浆甘油三酯及改善其胰岛素抵抗,相对于PPARα激动剂GW590735,效果更明显。
　　但是,由于PPARδ特异激动剂GW501516等药理学作用尚不清楚,还不能用于临床疾病的预防和治疗。所以,研究替米沙坦等ARB类药物对PPARδ的功能是否存在影响是非常必要的。由于骨骼肌胰岛素抵抗是2型糖尿病的特征性标志,我们假设替米沙坦激活PPARδ的表达和/或功能,从而影响骨骼肌的葡萄糖代谢。本研究分别于在体和离体水平对上述推论进行探讨,以期为高血压合并糖代谢紊乱的高危人群中高血压药物预防及改善胰岛素抵抗提供机制研究和理论依据。
　　胰岛素抵抗是机体对胰岛素生理作用的反应性降低,具体表现为外周组织对胰岛素敏感性下降以及对葡萄糖的利用障碍。外周胰岛素抵抗主要发生在脂肪、肝脏和骨骼肌,肝脏是外周葡萄糖利用的主要组织之一。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liverdisease,NAFLD)是一种无过量饮酒史、肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征,是导致胰岛素抵抗及2型糖尿病的重要危险因素。因此,改善非酒精性脂肪肝在调节葡萄糖代谢稳态上发挥重要作用。
　　目前,尚缺乏有效的药物治疗,所以生活方式干预仍然是非酒精性脂肪肝的一线治疗方法。膳食辣椒作为一种膳食方式在全世界范围广泛流行,而辣椒素是辣椒的主要成分,也是瞬时受体电位通道香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)的高选择性激动剂。我们的前期研究证实,慢性膳食辣椒素具有预防啮齿动物高脂饮食诱导的肥胖、降低血压、减少脂质在细胞内的堆积,降低高脂喂养ApoE-/-小鼠的血清总胆固醇、甘油三酯。我们课题组也发现,膳食辣椒素激活TRPV1可以改善高脂喂养小鼠的胰岛素抵抗。因此,膳食辣椒素干预激活TRPV1是否预防小鼠非酒精性脂肪肝的进展,与UCP2上调及促进脂质β氧化及脂质分解有何关联,是否改善对改善糖代谢有影响,尚需进一步研究。
　　本研究包括四个部分:1.C2C12细胞诱导成熟,观察替米沙坦不同浓度和不同干预时间对C2C12细胞PPARδ活性及表达的影响。2.用替米沙坦长期喂养PPARδ肌肉特异性基因敲除型(Muscle-specific creatine kinase–peroxisome proliferator–activated receptorδ–knockout,MCK-PPARδ-/-)小鼠及其同窝野生型小鼠,分别观察替米沙坦长期喂养后对小鼠的体重、进食量、葡萄糖耐量及胰岛素耐量等指标产生的影响。3.观察替米沙坦及胰岛素急性刺激后C2C12和原代培养WT小鼠的骨骼肌细胞葡萄糖摄取的不同变化。从分子水平观察替米沙坦对骨骼肌细胞及组织PPARδ、PPARα、PPARγ及其它胰岛素信号通路分子表达水平的影响,进一步研究替米沙坦影响骨骼肌葡萄糖代谢的分子机制。4.观察C57BL/6J、TRPV1-/-小鼠普通饮食组(ND)、高脂饮食组(HD)和高脂饮食加辣椒素组(HC)的进食量、血脂、肝组织甘油三酯、脂质沉积等变化,免疫印迹法检测肝组织UCP2表达。
　　材料和方法:
　　整个研究分在体和离体实验。在体实验,前三部分以MCK-PPARδ-/-小鼠及其同窝野生型小鼠作为模型。第四部分以C57BL/6J、TRPV1-/-小鼠为模型。离体研究前三部分以小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞和原代培养的野生型小鼠骨骼肌细胞为研究对象。第四部分以HepG2细胞为研究对象。
　　1.替米沙坦对骨骼肌细胞PPARs的表达及活性的影响。小鼠骨骼肌C2C12细胞诱导成熟后分别用PPARδ质粒pAdTrack-CMV–PPARδ转染细胞,替米沙坦、PPARδ、PPARγ和PPARα的拮抗剂干预后,荧光素酶检测C2C12细胞PPARδ活性,Westernblot技术分析C2C12细胞PPARδ、PPARγ、PPARα蛋白表达。
　　2.替米沙坦干预对小鼠胰岛素抵抗的影响。4-6周龄野生型(wild-type,WT)小鼠和MCK-PPARδ-/-小鼠各24只,随机各分为普食组、高脂饮食组。喂养20周后,高脂组小鼠再随机选取12只,进行替米沙坦干预10周,即高脂替米沙坦组。观测喂养第二周的进食量,每2周记录一次每只小鼠体重,分别于第20、30周时,进行腹腔内注射葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。干预至第30周,空腹过夜,取颈动脉血检测甘油三酯、总胆固醇和胰岛素,迅速取双侧腓肠肌,备提总蛋白和胞膜蛋白,-70℃冻存。
　　3.替米沙坦对骨骼肌细胞葡萄糖摄取功能的作用。采用原代骨骼肌细胞培养技术,培养WT小鼠骨骼肌细胞。C2C12细胞和原代培养骨骼肌细胞成熟后换用无血清培养基,加用棕榈酸、替米沙坦刺激24小时,再用胰岛素刺激后,氚-2-脱氧葡萄糖(3H-2-deoxyglucose,3H-2DG)检测细胞对2-脱氧葡萄糖(2-Deoxyglucose,2-DG)的摄取率。
　　4.替米沙坦改善骨骼肌细胞糖代谢的分子机制。C2C12细胞诱导成熟后,替米沙坦、PPARδ、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3kinase,PI3K)、PPARγ和PPARα的拮抗剂干预细胞,胰岛素刺激后提取细胞总蛋白和胞膜蛋白,Westernblot技术分析C2C12细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase,Akt)、Akt底物蛋白160(Akt substrate of 160 kDa,AS160)和磷酸化Akt、AS160,胞膜Glut4的表达水平。
　　5.替米沙坦干预改善小鼠胰岛素抵抗的机制研究。WT和MCK-PPARδ-/-小鼠普食、高脂、高脂替米饮食喂养后,Westernblot技术分析腓肠肌PPARδ、PPARγ和PPARα的表达,急性胰岛素刺激后Akt、AS160和磷酸化Akt、AS160,胞膜葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter4,Glut4)的表达水平变化。
　　6.膳食辣椒素激活TRPV1改善小鼠非酒精性脂肪肝。C57BL/6J、TRPV1-/-小鼠普食、高脂、高脂辣椒素饮食喂养24周,监测其进食量,干预结束后检测血脂、肝组织甘油三酯,油红染色观察肝组织脂质沉积等变化,免疫印迹法检测肝组织UCP2蛋白表达。
　　结果:
　　1.PPARδ表达于小鼠骨骼肌细胞。替米沙坦能激活PPARδ并上调PPARδ的活性和表达水平。替米沙坦激活C2C12肌管细胞PPARδ呈时间依赖性及剂量依赖性,并能增加PPARγ及PPARα的表达。
　　2.替米沙坦调控骨骼肌细胞PPARs的表达及活性。PPARδ、PPARγ和PPARα的拮抗剂都能显著抑制的替米沙坦诱导的C2C12肌管细胞PPARδ活性增加。PPARδ和PPARα拮抗剂(GSK0660和GW6471)可以产生叠加效应增强对C2C12肌管细胞PPARδ活性的抑制;而PPARδ和PPARγ拮抗剂(GSK0660和GW9662)合用则没有表现出叠加效应。
　　3.替米沙坦干预改善WT小鼠的胰岛素抵抗。以MCK-PPARδ-/-小鼠及其同窝野生型小鼠为观察对象。高脂饮食喂养20周,WT和MCK-PPARδ-/-小鼠即出现体重显著高于普食组,葡萄糖耐量、胰岛素耐量受损。替米沙坦干预后可逆转高脂饮食诱导的WT小鼠体重增加,降低血浆胰岛素、甘油三酯和总胆固醇水平,改善葡萄糖耐量,增加胰岛素敏感性。
　　4.替米沙坦通过上调PPARδ/PI3K/Akt/Glut4,增加骨骼肌细胞的葡萄糖摄取。棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的C2C12细胞,胰岛素诱导的Akt、AS160的磷酸化和细胞膜Glut4的表达非常弱,给予替米沙坦干预则可增强它们的表达。替米沙坦增强Akt、AS160的磷酸化和细胞膜Glut4的表达的作用可被PI3K抑制剂LY294002或PPARδ抑制剂GSK0660明显减弱。

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缩略语表

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摘要

第一章 前言

第二章 替米沙坦调控骨骼肌细胞PPARs的表达及活性

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三章 肌肉特异性PPARδ基因敲除小鼠模型的建立及替米沙坦对小鼠胰岛素抵抗的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第四章 替米沙坦激活小鼠骨骼肌PPARδ改善胰岛素抵抗的机制

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章 辣椒素激活TRPV1上调UCP2改善非酒精性脂肪肝

5.1引言

5.2材料与方法

5.3结果

5.4讨论

5.5小结

全文结论

参考文献

文献综述激活过氧化体增殖剂激活受体δ对糖脂代谢的影响

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

致谢