CpG-ODN c41免疫特性及无刺激性内化机制研究

摘要

在固有免疫中,TLR9能特异性识别微生物非甲基化CpG-DNA(CpG-ODN),激发MyD88信号级联,释放促炎因子TNF-α,IL-6等,对消除病原体入侵具有十分重要的意义。然而,当TLR过度活化,大量促炎因子释放,又会引起针对宿主自身的炎性病理损伤。在前期研究中,本课题组新发现的一种特殊的CpG-ODN分子,命名为CpG-ODNc41(CpG-c41),它内化入胞后并不引起细胞因子释放,无免疫刺激性。由此我们将CpG-c41的内化称为“无刺激性内化”。此外,CpG-c41能抑制刺激性CpG-ODN诱导的促炎因子释放,具有显著的抑炎作用,但其分子作用机制和免疫特性尚不完全清楚。本课题从多角度对CpG-c41的免疫特性,及其对TLR9信号通路抑制机制进行深入研究。
　　此外,在TLR9信号抑制途径研究中,除了作为TLR9配体的CpG-c41之外,miRNA作为一种负调控机制也引起了广泛关注。为了突破实验方法的局限性,寻找更多的与TLR9乃至整个Toll-样受体家族信号通路相关miRNA,本研究建立了一种目前最为完整的直接从前体miRNA预测成熟miRNA的miRNA预测模型,FOMmiR,并尝试用FOMmiR从非编码RNA中预测成熟miRNA后,在整个Toll-样受体信号通路相关分子的mRNA3’UTR中进行局部序列比对(Blast),探索miRNA的靶基因。
　　CpG-c41产生的TLR9信号通路抑制机制研究,以及探寻Toll-样受体相关信号通路miRNA有助于为临床抗炎抗过敏治疗提供新的策略。
　　目的:
　　明确CpG-c41的免疫特性及其无刺激性内化的机制,包括CpG-c41与刺激性CpG-ODN之间的竞争入胞如何发生,以及这种竞争在信号通路中所处位置。并建立准确的miRNA预测模型,探寻TLR9信号通路相关miRNA。
　　方法:
　　1.通过ELISA实验观察不同剂量CpG-c41对CpG-1826诱导的TLR9活化的影响,CpG-c41对CpG-1826诱导的TLR9活化不同的影响,CpG-c41对小鼠巨噬细胞免疫应答能力的影响;
　　2.采用免疫荧光实验和激光共聚焦定位来观察CpG-c41在胞内的内化转运过程;3.采用蛋白印记实验检测在CpG-c41作用下TLR9-MyD88下游信号通路的活化
　　情况;
　　4.运用生物信息学方法建立miRNA预测模型,并探寻TLR9信号通路相关miRNA。
　　结果:
　　1.CpG-c41作用细胞后,不引起细胞因子释放,表现出无免疫刺激性。
　　2.CpG-c41与CpG-1826同时作用于细胞情况下,CpG-c41能够有效抑制CpG-1826诱导的炎性细胞因子释放,产生了抑炎作用,且存在显著的量效关系。
　　3.在CpG-1826诱导的TLR9活化的不同时相点加入CpG-c41,对TLR9早期TNF-α释放和晚期IL-6均有显著的抑制作用,且越早加入CpG-c41,抑制效果越明显。
　　4.CpG-1826作用细胞24h后,显微镜观察到明显的凋亡泡,而CpG-c41作用后的细胞细胞形态正常。接受再次CpG-1826刺激时,CpG-1826预处理组丧失免疫应答能力,细胞因子释放水平显著降低;CpG-c41预处理组免疫应答能力受影响较小,细胞因子释放保持较高水平。
　　5.免疫荧光实验结果显示CpG-c41在早期内体中被TLR9识别。
　　6.蛋白印记实验结果显示CpG-c41并未激活TLR9-MyD88信号通路的下游通路;较单独CpG-1826刺激,用CpG-c41和CpG-1826的混合物作用于细胞后MyD88信号级联的下游子通路均受到显著的抑制。
　　7.建立了一种新的基于二级结构模式的定阶马尔科夫模型的miRNA预测算法,FOMmiR实现了从发夹结构序列预测成熟miRNA的全功能识别。
　　8.通过将由FOMmiR从非编码RNA中预测的成熟miRNA的反向互补链与Toll-样受体信号通路相关分子的mRNA3’UTR序列进行Blast比对,发现785条序列的907条miRNA与82个基因之间存在1340个交互作用,其中2条miRNA(miR-15a和miR-146a)在文献中有报道。
　　结论:
　　1.CpG-c41的免疫学特性
　　CpG-c41对刺激性CpG-ODN的抑炎效应具有显著的量效关系与时效关系。CpG-c41与CpG-1826浓度比为1:1时,TNF-α释放水平降低约50％,当浓度比为4:1时，TNF-a释放水平降低超过90%。在刺激性CpG-ODN作用细胞3h内加入CpG-c41,对早期TNF-a释放均有显著的抑制效果，30min中内加入效果最好;后期在20h内加入CpG-c41对晚期IL-6的释放均有显著的抑制效果，在16h之前加入效果更明显。
　　2.CpG-c41的抑炎作用机制
　　免疫荧光结果显示CpG-c41通过比CpG-1826更高效的内化过程入胞，并在早期
　　内体中被TLR9识别。正是CpG-c41对受体的高亲和力使其与刺激性CpG-ODN争夺受体，阻碍了刺激性CpG-ODN内化入胞与TLR9结合。
　　尽管CpG-c41与TLR9发生结合，然而蛋白印记结果显示CpG-c41并未激活TLR9-MyD88信号通路的下游NF-kB和MAPKs通路，因此CpG-c41并不引起细胞因子的释放，无免疫刺激性。加入CpG-c41后，CpG-1826诱导的TLR9-MyD 88信号通路的下游通路活性显著降低，从而产生抑炎效应。
　　3.TLR9通路相关miRNA
　　为了突破实验方法的局限性,寻找更多的与TLR9乃至整个Toll-样受体家族信号通路相关miRNA,我们建立了一种最为完整的直接从前体miRNA预测成熟miRNA的miRNA预测模型,FOMmiR。并尝试用FOMmiR从非编码RNA中预测成熟miRNA,并在整个Toll-样受体信号通路相关分子的mRNA3’UTR中进行局部序列比对(Blast),探索miRNA的靶基因,结果中有2条miRNA已有文献报道。

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缩略语表

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中文摘要

第一章 前言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 CpG-c41的免疫特性

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 小结

第三章 CpG-c41无刺激性内化机制

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 小结

第四章 探寻TLR9信号通路相关miRNA

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 小结

全文总结

参考文献

文献综述受体介导的内吞作用在胞内Toll-样受体信号

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢