胚鼠神经干细胞对老年小鼠初级听皮层的影响

摘要

背景
　　老年性聋是随着年龄增长而出现的双耳进行性听力下降,为临床的常见病,严重影响着老年人的生活质量。听力下降常削弱交换信息,造成孤独、分离、依赖、挫折及沟通障碍,使得此类人群抑郁症的患病率明显升高。随着我国社会老龄化的加剧,老年性聋逐步演变为一个日益严重的问题。目前尚没有治疗老年性聋的有效和可靠的方法,这已成为亟待解决的问题。
　　神经干细胞移植可诱导受损大脑组织再生,可能成为治疗神经退行性病变最有前途的治疗工具。治疗证据包括:移植的神经干细胞通过对抗大脑损伤造成的炎性反应,减轻大脑损伤,间接保护大脑组织;移植的神经干细胞可分化为神经元,直接对损伤的大脑组织及凋亡组织起到修复作用;神经干细胞移植后可以分泌多种神经生长因子,对周围组织细胞提供营养,有效促进新生神经元的再生;神经干细胞移植后可对抗细胞凋亡。研究显示,神经干细胞移植后凋亡细胞明显减少,并且凋亡蛋白表达明显减少。鉴于神经干细胞移植的多方面的修复和促进作用,它已成为研究的热点,而且可能成为治疗神经退行性疾病包括老年性聋及神经损伤性疾病的新方法。
　　基于以上研究,本研究将培养的胚鼠神经干细胞移植入老年鼠模型C57BL/6J老年鼠的初级听皮层区域,通过免疫荧光技术对移植的神经干细胞进行追踪,观察分化情况。对其进行听功能检查,观察效果。检测听皮层区域caspase-3、bcl-2及β-catenin蛋白表达变化,对移植治疗的机制进行初步的探讨。
　　研究目的
　　1.探讨胚鼠神经干细胞培养方法,即分离培养胚鼠脑神经干细胞,寻找便捷、快速的方法。
　　2.对分离培养的胚鼠神经干细胞进行鉴定,即鉴定培养的细胞是否为神经干细胞,确定分离培养方法的可靠性。
　　3.探讨神经干细胞对老年小鼠初级听皮层的影响,即神经干细胞移植后对老年小鼠听功能的作用及其可能的作用机制。
　　实验方法
　　1.选取孕14-15d的孕鼠,在无菌条件下取出胚鼠,分离胚鼠大脑皮层,分别用酶消化法及机械吹打法培养,对分离下来的神经干细胞进行细胞计数,用CCK8分别检测两种方法分离培养的细胞增殖情况。
　　2.用免疫荧光技术对酶消化法分离培养的细胞进行神经干细胞特异性标志物巢蛋白(nestin)检测,分离培养的神经干细胞去除生长因子,并加入胎牛血清诱导其分化,培养7天后,利用免疫荧光技术对其进行神经元特异性标志物β微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)和星形胶质细胞特异性标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测。
　　3.利用立体定向技术把培养的胚鼠神经干细胞移植入老年鼠初级听皮层区域,移植1周、2周、3周、4周后对小鼠进行ABR听功能检测。利用免疫荧光、westernblot、TUNEL、HE染色等技术观察移植后神经干细胞分化情况、神经元凋亡情况、肿瘤形成情况、相关蛋白表达变化情况。
　　实验结果
　　1.酶消化法分离下来的神经干细胞比机械吹打法多,机械吹打法分离的神经干细胞杂质比较多,CCK8检测显示酶消化法分离培养的细胞比机械吹打法增殖快。酶消化法分离培养的神经干细胞增殖成神经干细胞球,形态比较规则;而机械吹打法分离的神经干细胞由于杂质的影响成云片样生长,不规则,经多次传代后才能形成规则的神经干细胞球。
　　2.神经干细胞自我增殖为神经干细胞球,经免疫荧光鉴定后显示nestin阳性。神经干细胞可诱导分化为β-tubulinⅢ免疫阳性的神经元及GFAP免疫阳性的星形胶质细胞。
　　3.胚鼠神经干细胞移植后,移植组的老年鼠听功能得到部分恢复,听力阈值降低,特别是高频听力比较明显。移植的神经干细胞可分化为β-tubulinⅢ免疫阳性的神经元,移植1周后β-catenin蛋白表达升高。移植2周、3周后caspase-3蛋白表达降低,移植2周、3周、4周后bcl-2蛋白表达升高,并且神经元凋亡减少。移植2周后针孔损伤愈合,且移植半年后未见肿瘤生长。
　　结论
　　1.胚鼠神经干细胞分离培养时,酶消化法比机械吹打法更便捷、快速,获得的神经干细胞多且杂质少。
　　2.分离培养的胚鼠神经干细胞可成功诱导分化为神经元和星形胶质细胞,具有自我增殖和多向分化能力,分离培养方法可靠。
　　3.胚鼠神经干细胞移植对C57BL/6J小鼠老年性皮层聋有一定的改善和治疗作用,可能是通过抑制凋亡途径或是通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进移植的神经干细胞分化修复损伤的神经元,进而对听皮层产生影响,达到改善听功能的作用。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 C57BL/6J胚鼠听皮层神经干细胞分离培养的研究

2.1材料及方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三章 胚鼠神经干细胞增殖分化鉴定

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4结论

第四章 植入胚鼠神经干细胞对老年小鼠听皮层的影响

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4结论

全文小结

参考文献

文献综述干细胞移植在治疗神经退行性病变和神经元凋亡的机制

参考文献

研究生期间发表的论文

致谢